Разработка методов исследования транспортировки макромолекул между ядром и цитоплазмой, а также выявление неправильной локализации белков супрессора опухоли имеет важное значение для получения более глубокого понимания патогенеза ХЛЛ и помощи в разработке новых методов лечения. Этот протокол обеспечивает быстрый и эффективный метод генерации ядерных и цитоплазмических фракций из первичных клеток ХЛЛ. Эти фракции могут быть использованы в экспериментах вниз по течению, включая анализ ферментной активности, протеомный анализ и западные blotting.
Этот метод расширит наше понимание того, как терапия и микро-экологические сигналы в опухолях изменяют комок белков между ядром и цитоплазмой в клетках ХЛЛ и потенциально других злокачественных новообразований В-клеток. Этот метод может быть использован для определения местонахождения белков и / или привлечения движения белка по мере необходимости. Выполните градиент моющего средства на каждой отдельной клеточной линии, которую вы планируете использовать для обеспечения оптимального генерации высокообогащенной ядерной и цитоплазмической фракций.
Наряду с Джоди Хэй и Майкл Молс, демонстрируя эту процедуру будет Дженнифер Касселс, техник из моей лаборатории. Получить образцы периферической крови от ранее согласился хронических лимфоцитарный лейкоз пациентов в EDTA крови сбора труб, сопровождается белыми клетками кол. Образцы крови человека следует рассматривать как опасные, поскольку они потенциально содержат вирусы, передаваемые через кровь.
Пожалуйста, убедитесь, что эти образцы обрабатываются в классе два био-безопасности шкаф и что пользователь носит лабораторное пальто и перчатки во все времена. Утилизация загрязненных кровью материалов в дезинфицирующих средствах. Если количество белых клеток равно или превышает 40 миллионов клеток на миллилитр, разбавьте образец в соотношении один к одному с буфером для мытья RT CLL.
Затем aliquot RT плотность градиента среды в соответствующих размеров конической центрифуги трубки для образца. Тщательно слой образца на верхней части среды и центрифуги на 400 х г в течение 30 минут на RT. Используя пластиковую трубу Pasteur, аккуратно соберите белый слой моноядерных ячеек, собранных на стыке градиентной среды плотности в буфере мытья CLL. Перенесите этот изолированный монослой в свежую 50-миллилитровую коническую центрифугу.
Чтобы промыть клетки, добавьте 40 миллилитров буфера для мытья CLL в этот монослой и центрифугу при температуре 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант, щелкнуть дно трубки, чтобы вновь приостановить гранулы, и повторить эту стирку. Отбросьте супернатант, флик нижней части трубки снова, а затем повторно приостановить ячейки гранулы в наборе объем буфера мытья CLL в зависимости от размера гранулы.
После подсчета клеток и после цитометрии потока, чтобы проверить чистоту клеток, поместите клетки в пластины культуры тканей при необходимой плотности клеток, готовых к стимуляции или медикаментозному лечению. После стимуляции и/или медикаментозного лечения инкубация завершена. Перенесите клетки в индивидуально помеченные 1,5-миллилитровые трубки микротоки и гранулы путем центрифугирования при 200 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После отбрасывания супернатанта, повторно приостановить гранулы клетки в один миллилитр ледяной PBS с ингибиторами фосфатазы. Центрифуга при 200 x g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант и держите эти гранулы экстракта всей клетки на льду для дальнейшей подготовки.
Чтобы подготовить цитоплазмические фракции, аккуратно повторно приостанавливайте клеточные гранулы в 50 микролитров 1x гипертонической буфера. Чтобы клетки опухли, инкубировать их на льду в течение 15 минут. После выполнения градиента моющего средства для определения оптимальной концентрации моющего средства для использования для определенного типа клеток, добавьте от 0,8 до 2,5 микролитров моющего средства в каждый образец и вихрь на самом высоком параметре в течение 10 секунд.
Для проверки клеточного лиза наблюдайте за клетками под фазовой контрастной микроскопом до и после добавления моющего средства. Все клетки имеют плотное темное ядро, окруженное цитоплазмой, которая выглядит как яркий ореол. После лисуса центрифуга образцов при 14 000 х г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.
Осторожно, не нарушая гранулы, перенесите супернатант в предварительно охлажденную трубку с маркировкой микрофуза и храните эту цитоплазмическую фракцию при 80 градусах по Цельсию до дальнейшего анализа. Обеспечить полное удаление цитоплазмической фракции для предотвращения загрязнения ядерной фракции. К оставшейся грануле, которая содержит ядерную фракцию, добавьте 50 микролитров полного буфера лиза и повторно приостанавливайте трубами вверх и вниз.
Для растворимки белков, связанных с ядерной мембраной, добавьте 2,5 микролитров моющего средства, вихрь на самой высокой установке в течение 10 секунд и инкубировать на льду в течение 30 минут. Вихрь на самом высоком уровне в течение 30 секунд и центрифуга. Затем перенесите супернатант в предварительно охлажденную трубку с маркировкой микрофьюджа и храните эту ядерную фракцию при 80 градусах Цельсия до дальнейшего анализа.
Для целых лизов клеток, повторно приостановить всю ячейку экстракт гранулы в 100 микролитров полного буфера лиза путем трубопроводов вверх и вниз. Для обеспечения полного клеточного лиза добавьте пять микролитров моющего средства и инкубировать на льду в течение 30 минут. Вихрь на самом высоком месте в течение 30 секунд, а затем центрифуга на 14000 х г в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию.
Перенесите супернатант в предварительно охлажденную трубку микротехи и храните лизат всей клетки при 80 градусах Цельсия до дальнейшего анализа. Для количественной оценки оборота белка между ядерными и цитоплазмическими фракциями, выполнить количественный западный анализ помарки и импортировать изображения. Чтобы отобразить изображение в ленте Изображения, нажмите кнопку Выберите в группе Отображения и нажмите на канал Chemi.
Диалог Выберите дисплей откроется, чтобы включить дальнейшие корректировки, если это необходимо. Внедрение дополнительных усовершенствований с использованием регулируемых ползунок на вкладке LUT изображения, включая яркость или контрастность. Используйте вкладку Кривые для более тонких корректировок.
Для анализа данных сначала нажмите на ленту анализа. Чтобы проанализировать только один канал, отбирайте каналы, которые не анализируются, нажав на миниатюру канала Don't Show Channel, оставляя только нужный канал. Для количественной оценки интенсивности сигнала нажмите Add Rectangle, чтобы добавить прямоугольники к изображению.
Нажмите на центр функции, такой как белковая полоса, чтобы разместить прямоугольник вокруг него. После добавления желаемых форм нажмите Select, чтобы вернуть курсор инструменту выбора. Чтобы вычесть фоновый шум, нажмите на первую кнопку в фоновой группе и выберите Median из меню высадки.
Установите ширину границы до трех в диалоге background и выберите сегменты, которые лучше всего представляют фон изображения, который будет использоваться для фонового расчета. Чтобы экспортировать данные, нажмите на вкладку Shapes над таблицей. Для денситометрии требуются значения в столбце Сигнала.
Сигнал – это сумма значений интенсивности пикселей или всего для формы минус продукт фона в области. Затем нажмите кнопку Отчет, нажмите Сохранить Как или Запуск таблицы. Чтобы вычислить нормализованное выражение белка интереса для каждой плоскости или переменной в сохраненной электронной таблице, разделите полученный сигнал на белок интереса сигналом для соответствующей группы контроля загрузки белка.
Чтобы экспортировать изображение, нажмите на вкладку Изображения, найденную над таблицей, а затем нажмите на изображение, которое будет экспортироваться. При использовании изображения для слайд-презентации или других цифровых форматов щелкните значок программного обеспечения, наведите курсор на Export, нажмите на изображение для digital Media, а затем сохраните изображение по мере необходимости. Обогащение клеток CLL с WCC более 40 миллионов на миллилитр с использованием центрифугации плотности обеспечивает высокое восстановление клеток.
Анализ образца по цитометрии потока после замыкания на FSC и SSC показывает чистоту клеток CLL более чем на 95%, о чем свидетельствует двойное выражение поверхности маркеров клеток CLL, CD19 и CD5. Когда иммуномарки были выполнены на результате фракции линии клеток CLL, Mac-1, и первичных клеток CLL, фракционирование показало, что оптимальный уровень моющего средства для клеток Mac-1 был на один до 60 разбавления, по сравнению с одним до 30 для первичных клеток CLL. Когда субклеточная локализация FOXO1 в ядерных и цитоплазмических фракциях была определена в клетках Mac-1 и первичных CLL, генерация высокообогащенные фракции была показана почти исключительным выражением ламина в ядерном и бета-тубулине в цитоплазмических фракциях.
Выражение FOXO1 было уменьшено в цитоплазме после обработки с A'D 8055, сравненным к NDC, сопровождаемому увеличением выражения FOXO1 в ядерном отсеке, таким образом демонстрируя транслокацию протеина. После того, как отдельные иммуномарки из пяти первичных образцов ХЛЛ были количественно определены в рамках субклеточных фракций, было установлено, что AD 8055 снижает уровни экспрессии FOXO1 в цитоплазме и увеличивает экспрессию в ядре. BCR кросс-связывания увеличение цитоплазмической FOXO1 выражение.
Не забудьте сохранить все реагенты и образцы на льду, чтобы предотвратить деградацию белка. Субклеточные фракции, генерируемые в этой процедуре, также могут быть использованы в анализах активности ферментов, таких как анализ активности FOXO, который позволяет проводить параллели между клеточным расположением FOXO1 и его активностью связывания ДНК. Разработка этого метода позволила нам решить проблему незаконного оборота конкретных белков в клетках ХЛЛ в ответ на селективные ингибиторы и поддерживает наши параллельные исследования иммунофлуоресценции для создания надежного и поддающихся количественной оценке набора данных.
