В этом обзоре мы обсудим как визуализационные, так и биохимические методы, используемые для изучения позиционирования и состава органелл, а также цитоскелетные перестановки, наблюдаемые при формировании иммунологического синапса. Начальные этапы активной реконструкции позволяют В-клеткам увеличить поверхность клетки и максимизировать количество антигенных комплексов BCR, собранных в синапсе. С другой стороны, местный набор лизосом, вместе с центросомой в синаптической мембране, может быть соединен с лизосомной секрецией, которая, как известно, облегчает экстракцию обездвиженные антигены.
Поглощенный антиген дополнительно обрабатывается в эндолизосомных отсеках в пептиды, которые загружаются на молекулы класса II MHC для представления клеткам T-помощников. Таким образом, изучение динамики органеллы, связанной с иммунной синапсис имеет решающее значение для понимания того, как В-клетки полностью активированы. Иммунофлуоресценция В-клеток, активированных иммобилизованными антигенами, позволяет нам следовать различным клеточным компонентам и тому, как их можно набрать в иммунную синапсу.
В-клетки могут быть активированы с помощью обездвиженых антигенов на поверхности шарика или поверхности крышки. Антигенные бусины готовятся путем инкубации конкретных лигандов с аминокислотами, ранее обработанными глутаралдегидом для активации аминокислотных групп. Resuspend активировал бисер в 100 микролитров PBS и вихря.
Между тем, подготовить антигенный раствор, добавив 100 микрограмм на мл BCR лиганда в 150 микролитров PBS. Затем добавьте 50 микролитров активированных бусин в раствор антигена и инкубировать на ночь при четырех градусах цельсия. Помните, также используйте несвязанный лиганд в качестве отрицательного контроля.
После инкубации вымойте бисер с помощью PBS. Аспирировать супернатант и заменить PBS. Повторите три раза.
Затем блокируйте три группы аминокислот, перерасходуя бисер в 500 микролитров раствора BSA. Наконец, повторное распределение бисера в 70 микролитров PBS. Чтобы рассчитать окончательную концентрацию, можно использовать гемоцитометр для подсчета бисера.
Для активации В-клеток используйте 50 мл трубки и повторно помыть клетки до концентрации 1,5 миллиона на мл в CLICK, дополненной сывороткой из крупного рогатого скота 5%. Далее добавьте 150 000 В-клеток, соответствующих 100 микролитров смеси бисера клетки, в поли-L-лизин-покрытие крышки объявление инкубировать на 37 градусов для различных точек времени. Второй подход к активации В-клеток является посев их на антиген покрытием coverslips.
Для этого, пальто слайды с анти-BCR и B220 с улучшает адгезии клеток. Подготовьте раствор антигена, добавив анти-BRC и B220 в PBS к окончательной концентрации 10 микрограмм на мл и 0,5 микрограмма на мл, соответственно. Затем установите крышку над крышкой 24 хорошо пластины покрыты парафильмовой пленкой и добавить 40 микролитров антигенного раствора.
Печать пластины, а затем инкубировать при 4 градусах на ночь. Чтобы начать активацию в coverslip, сначала мыть их с PBS и дайте им высохнуть в течение нескольких минут. Затем добавьте 150 000 В-клеток и инкубировать при 37 градусах для разных точек времени.
В обоих случаях, при активации либо с бисером или антиген покрытием слайды, мы рекомендуем, начиная с самой длинной точки времени, а затем переступить к более коротким. После того как вы установили сухую крышку на слайд микроскопа, вы можете использовать эпифлуоресценцию или конфокальный микроскоп для просмотра образцов, в зависимости от требований разрешения. Сосредоточьте образец с помощью передаваемого света.
Вы должны искать поля, где клетки и бусы взаимодействуют в одном и одном соотношении. Для B-клеток, активированных на антигенных обложках, используйте цель 100x для лучшего разрешения. Для параметров, рассмотреть вопрос о принятии z-стек, который охватывает всю ячейку.
Вы можете обозначить актин для разграничения нижних и верхних границ ячейки. Для В-клеток, активированных с антигенным покрытием бисера и этикетки его для органелл ограничивается одной точкой, первый делимит две области: область клетки и бисера области. Затем определите положение или органеллу по точке и получите ее координаты локализации.
Нарисуйте два вектора: один между центром клетки и органелью, а другой между центром клетки и центром бисера. Измерьте длину обоих и измерьте угол между двумя векторами, которые теперь называют альфа. Сделайте проекцию с вектором между центросомой и клеточным центром с помощью гуассяна альфа, а затем вычислите индекс полярности органеллы, разделив проецируемый вектор а, на b.
Таким образом индекс полярности между нулем и одним показывает поляризованный фенотип. Значения от нуля до минус одного указывают на неполяризованный фенотип. Для того, чтобы определить индекс полярности для более рассеять органеллы, такие как лизосомы, можно использовать тот же алгоритм, упомянутый ранее, изменяя координаты локализации органеллы для координат массового центра меток, в данном случае, лизосом.
Как и описанный ранее анализ, индекс полярности между нулем и индексом указывает на поляризованный фенотип, в то время как значения между нулем и минусом указывают на неполяризованный фенотип. Для количественной оценки количества каждой органеллы, тесно набранной в новый синапс, можно рассчитать процент органеллы флуоресценции на бисере. Для этого необходимо разграничить область бисера и клетки, измерить соответствующие интенсивности флуоресценции, а затем разделить флуоресценцию шарика на сумму шарика и флуоресценции клеток.
Вы получите количество каждой органеллы, которая находится в контакте с новым синапсом. Кроме того, нарисуйте прямоугольник напротив шарика. Используйте вес, соответствующий четверти длины клетки, а затем измерить интенсивность флуоресценции в прямоугольнике и разделить его на общую флуоресценцию.
Этот алгоритм всегда будет получать процент органеллы, которая находится близко к новой синапсе, но не обязательно в прямом контакте с интерфейсом. Для количественной оценки связанных с центросомой компонентов в отдыхающих и активированных В-клеток. Короче говоря, мы определяем три параметра.
Область клетки и бисера, а также координаты центросомной локализации. Далее мы определяем круг вокруг центросомы и запускаем радиальный анализ профиля из центра центросомы, ранее определенного. Если у вас есть участок, определить радиус, при котором 70% от максимальной флуоресценции поддерживается.
Используйте этот радиус, чтобы нарисовать круг, окружающий центросому. Наконец, получить плотность флуоресценции компонента интереса в центросомной области и области клетки, и разделить оба значения, чтобы получить соотношение флуоресцентной плотности. Для измерения распределения органелл в иммунном интерфейсе синапса, сначала определите область В-клеток в контакте с антиген-покрытием coverslip.
Вы можете пометить actin, чтобы помочь вам определить эту область. Затем измерьте область контакта с горкой, высоту и ширину ячейки. Область, стоящая перед антигенным покрытием крышки скольжения является измерение B клеток распространяется на активации В-клеток.
Используйте значения высоты и ширины для разграничения центральной области в ячейке, которая отделена от границ четвертью высоты и значения ширины. Обычно они соответствуют примерно трети общей площади ячейки. Наконец, рассчитайте набор органелл в центре нового синапса, разделив плотность флуоресценции в центральной области на плотность флуоресценции всей клетки.
Положительные значения этого индекса указывают на обогащение органеллы в центре нового синапса. Напротив, отрицательные значения указывают на периферийное распределение. Для измерения распределения органелл по z-плоскостям В-клеток, активированных на антигенных крышках, сначала делимитируют синаптический интерфейс и верхний предел клетки.
Затем нарисуйте линию через центр ячейки и повторно нарисуйте изображение, чтобы получить изображение X. Измерьте головную часть клетки и разделите изображение на 10 фракций одной и той же области, от иммунного синапса до верхнего предела клетки. Измерьте флуоресценцию в каждой z-фракции и вычислите процент флуоресценции, разделив флуоресценцию на каждую z-фракцию на общую флуоресценцию клетки.
Наконец, участок процент флуоресценции интенсивности на z-фракции. Фракция один и два представляют собой синаптический интерфейс. Вот рабочий процесс или процедура центросомной изоляции.
Используйте 20 миллионов В-клеток на условие. Предварительное лечение клеток циточалазином D и нокодазолом в соответствии с требуемым протоколом для облегчения центросомного отслоения. Далее, смотреть клетки, перерасход их в 5 мл буфера TBS.
Повторите с помощью 1 мл буфера 0,1x TBS, дополненного 8%-ной сахарозой. Повторное производство клеточных гранул с 150 микролитров буфера лиза. Центрифуга при 10 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия отделяет цитозол и органеллы от ядра.
Тщательно восстановить клеточного супернатанта и место на вершине 1,5 мл трубки. Заполните его 300 микролитров градиентного буфера, дополненного 60% сахарозой. Образцы центрифуги при 10 000 г в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
Этот шаг центрифугации имеет важное значение для концентрации центросом. После центрифугации, тщательно удалите супернатант, пока не достигнете интерфейса. Вихрь образца, оставшегося в трубке.
Подготовка прерывистого градиента сахарозы в ультрацентрифугной трубке путем наложения 0,45 мл 70% сахарозы, с 0,27 мл 50% сахарозы, а затем 0,27 мл 40% сахарозы в градиентном буфере. Поместите обогащенные центросомой образцы на прерывистый градиент и откалибруйте вес каждой выборки в соответствующих адаптерах. Центрифуга труб при 40 000 г в течение 1 часа при 4 градусах Цельсия, с минимальным ускорением и без перерыва, чтобы избежать возмущения градиента.
После центрифугации тщательно соберите 12 фракций с равным объемом. Переподходить образец с буфером загрузки и запустить SDS-PAGE. Для изучения распределения органелл в клетках группы В во время формирования иммунной синапзы мы использовали 2A1.6 B-клетки, активированные с антигенным покрытием бисером для различных точек времени.
В качестве контроля, B-клетки были активированы с бисером, содержащим не связанных BCR-лиганд. Затем мы, используя иммунофлуоресценции окрашивания, обнаружить различные органеллы, которые меняют их локализации при активации с обездвиженными антигенами. Мы показываем здесь центросому, помеченную альфа-тубулином и голги аппаратом с надписью Rab6a.
На графике мы показываем индекс полярности для центросомы и golgi аппарата полярности верус каждый момент активации, в котором каждая точка представляет одну ячейку. Во время активации мы можем заметить, что индексы полярности для этих органелл достигают значений ближе к 1, предполагая увеличение их набора в IS.Organelles, которые отображают более рассеянное распределение, такие как лизосомы, также могут быть количественно с помощью индекса полярности. Мы можем заметить, что индекс полярности лиососомы достигнет более позитивных значений при активации, что является результатом вербовки в IS. Мы показываем дополнительный подход к количественной оценке набора лизосомы к иммунной синапсе.
Используя тот же протокол активации с антигенным покрытием бисера, лизосом вербовки в IS был рассчитан путем количественной оценки флуоресценции этикетки лиосомы завербованы в области, определенные вокруг шарика или в синаптической области. Мы можем наблюдать, что открытая активация. Существует увеличение lysosomes в сочетании с сайтом синапса.
Здесь мы представляем количественную оценку актина в центросоме в клетках группы В, активированных специфическими и неспецифическими антигенными бусинами. Пул актина обозначен стрелкой. Количественная оценка связанных с центросомой компонентов, таких как актин в данном случае, может быть представлена точечным сюжетом, в котором каждая точка представляет одну ячейку.
После активации, В-клетки уменьшаются в количестве актина вокруг центросомы. Этот шаг имеет важное значение для отделения центросохимии от перинуклеарной области, с тем чтобы позволить ее поляризации к новому синапсу. Для B-клеток, активированных на поверхности с антигенным покрытием, вы можете изучить актин ремоделирования, а также набор органелл в синаптической мембраны.
Здесь мы покажем анализ органелл, таких как аппарат golgi и эндоплазмический стикулум, которые отображают центральное и периферическое распределение, соответственно. Кроме того, мы можем рассчитать область распространения В-клеток после различных точек времени активации. Для этого мы марким actin, чтобы иметь возможность определить предел ячейки в плоскости XY.
На графике можно наблюдать увеличение площади клетки после 30 и 60 минут активации. Распределение органеллы также может быть рассчитано в плоскости X' в соответствии с синаптической интерфейсом. График представляет собой распределение актина в z-самолете, где первые две плоскости соответствуют синаптической интерфейсу.
Мы можем наблюдать, что актин обогащается в этой области после активации. В дополнение к анализу изображений, биохимический подход может также использоваться для изучения изменений в составе центросомы при активации В-клеток. Мы показываем здесь репрезентативную западную помарку центросодержащей фракции, выделенной бежевым прямоугольником.
Центросомные фракции были выделены на градиент сахарозы и обнаружены при выравниваи гамма-тубулина. Западная помарка ниже показывает актин и Arp2 в центросомных фракциях от отдыхая клеток b, которые будут истощенными на активации. B лимфоциты претерпевает динамические изменения на мембранном интерфейсе для того, чтобы сформировать функциональный иммунный синапс.
Этот процесс можно изучить с помощью изображений и биохимических методов, описанных здесь в этом видео. Мы считаем, что этот анализ может предоставить ценную информацию о молекулярных механизмах, связанных с тем, как В-клетки могут эффективно активироваться.
