Центральной целью разработки метода csBN-MS было получение комплексного доступа к организации и сборке белковых комплексов, которые лежат в основе трансдукции сигнала на плазменной мембране и через нее различных типов тканей и органов. csBN-MS в настоящее время обеспечивает наивысшее разрешение универсальности для анализа родного белкового комплекса и их подразнитественного состава, в частности в отношении мембранных белков. Хотя метод csBN-MS был разработан для анализа сложных смесей мембранных белковых сборок в мозге грызунов, он может быть легко адаптирован к анализу любого типа биологического образца.
Одним из ключевых шагов нашего метода является встраивание геля и его правильное выравнивание в режущей плоскости перед нарезкой. Будьте осторожны, чтобы не разорвать или сжать гель и убедитесь, что он не наклонен к плоскости резки, так как это позволит уменьшить разрешение анализа. Наша методика csBN-MS имеет несколько практических шагов, которые имеют решающее значение для хороших результатов.
Легче показать, как выполнить эти шаги в деталях, чем просто описать их. Для начала этой процедуры используйте перемешивание двухкамерный градиент смеситель управляется насосом, чтобы бросить линейный или гиперболический гель градиента поры. Подготовка решений для передней смешивая камеры и резервуарной камеры, как указано в текстовом протоколе.
Запустите мешалка и добавьте 30 микролитров APS и 2,5 микролитров TEMED к раствору в передней камере. Затем запустите насос и откройте передний клапан. Примерно через минуту добавьте в камеру резервуара 90 микролитров APS и пять микролитров TEMED и откройте камерное соединение.
Разрешить гель полимеризации медленно и тщательно, по крайней мере 24 часов при комнатной температуре для создания однородной градиент размера поры. При влажности полимеризованный гель можно хранить в вертикальном положении при четырех градусах Цельсия в течение одной недели. Затем подготовьте погрузочные слоты, вставив соответствующие пространства между стеклянными пластинами для разделения между 0,5 и 2,0 миллиграммами белка.
Ширина слотов должна быть не менее трех сантиметров. Для запуска буферов подготовьте стоячий катодный буфер, состоящий из 50 миллимолярных трицинов, 50 миллимолейных Бис-Трис и 0,01%Кумасси G-250. Подготовь стандартный анодный буфер, состоящий из 50 миллимолярНых Бис-Трис.
Solubilize приблизительно 2,5 миллиграмма мембраны и два миллилитров буфера solubilization, содержащего 1%non-denaturing моющее средство на льду в течение 30 минут. Затем ультрацентрифуг на 130 000 раз G в течение 11 минут. Сосредоточьте солубилизат на коротком градиенте шага 50%20%sucrose путем ультрацентрифугации при 400 000 раз G в течение одного часа.
После этого, урожай градиента сахарозы из нижней части трубки, добавить 0,05%Кумасси G-250 в solubilisate, и загрузить образец на гель. Запустите препаративную BN-PAGE при 10 градусах Цельсия за одну ночь с помощью трехшагового протокола напряжения, как указано в текстовом протоколе. После того, как гель работает сканирование гелей для целей документации, сохраняя его между стеклянными пластинами.
Осмотрите качество разделения геля. Далее, рассеять пластины и акциз переулок разделы интереса. Исправить полосы в два раза с 30%этанола и 15%acetic кислоты, по крайней мере 30 минут.
Перенесите образец встраивания среды и дайте ему впитаться и уравножить, по крайней мере два часа, сохраняя при этом гель плиты в замедленном движении на орбитальной шейкер. Затем разрежьте фиксированные гелеобразные полосы на участки, точно параллельные фронту миграции белка, или шаблону полосы. Поместите каждый раздел на пластиковую поддержку пленки с равными размерами для облегчения обработки.
Перенесите полосы движения в открытую трубку с пробками, которые закрыты внизу и централизованно перфорированы сверху, как точно выровнены с верхним и нижним концами раздела геля. Опустите цилиндр в жидкий азот на короткое время, чтобы быстро инициировать затвердевание. Прозрачная среда встраивания затвердевает в течение нескольких секунд и становится белой по цвету.
Заполните полость средой встраивания, кратко окуните цилиндр в жидкий азот, а затем дайте ему тщательно замерзнуть при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких часов. После разборки снимите пластиковую пленку и перенесите блок со встроенной секцией геля в охлажденный металлический цилиндр. Цилиндр больше в диаметре и запечатан снаружи с встраиванием среды.
Он расположен на плоской опоре. Заполните цилиндр с встраиванием среды и заморозить тщательно, как упоминалось ранее. Повторите эту процедуру с другой стороны цилиндра, чтобы получить твердый блок с coplanar нижней поверхности.
Затем снимите блок с цилиндра и используйте встраивание среды, чтобы приклеить его к предварительно охлаждемуся металлическому держателю. Вставьте металлический держатель в криослойную машину. Владелец должен быть тщательно выровнен по отношению к нарезке плоскости.
Позвольте блоку уравнять до оптимальной температуры для процесса нарезки. После этого урожая гель ломтиками один за другим с окончательной желаемой толщиной 0,25 миллиметра шаг размера и передать их индивидуально реакции труб с низкими свойствами связывания белка. Затем ломтики подвергаются триптическому дайджесту и масс-спектрометрическому анализу.
Этот протокол расширяет применение комплексного профилирования с высоким разрешением на не митохондриальные мембраны, выражаюющие белки с низким содержанием изобилия. Комплексное разделение показывает сильно окрашенные белковые полосы с очень небольшим количеством миграционных артефактов. Отклонения пептидных сигналов в массе и времени удержания указывают на очень низкую скорость ложноположивного пикового назначения объема.
Запускаемые вариации легко устраняются путем повторного увеличения пикового объема наборов данных. Полученная информация об интенсивности пептида затем используется для реконструкции 2545 белковых профилей относительного изобилия. Актуальность размера шага отбора проб геля для разрешения белковых комплексов оценивалась путем присоединения наборов данных соседних ломтиков.
При 0,25 миллиметра, размер разделения TPC1 связанных сложных популяций приятно в согласии с результатами западного анализа помарки. Присоединение более чем двух срезов отменяет дискриминацию сложных субпопуляций TPC1. Наконец, анализ содержит информацию о хорошо охарактеризованных комплексах и демонстрирует существование новых подразделений и сложных сборок.
Что касается ферритина, то профили подразделений, скорректированные с учетом их относительного изобилия, свидетельствуют о существовании по крайней мере трех сложных изоформ с отчетливыми тяжелыми/легкими цепными стоихиометриями. В отличие от этого, комплексы никалин-номо1, комплекс гамма-секретазы и оборудование GPI-трансамидазы показывают фиксированные коэффициенты изобилия их основных подразделений по всему диапазону размеров и независимы от ассоциации с дополнительными белками. Ключевым параметром анализа csBN-MS является эффективное разрешение комплексов, которое определяется выборочных биохимией, качеством геля BN, надлежащей выравниванием при встраивании и нарезке, а также качеством приобретенных данных о MS.
Расчесывание csBN-MS с изотопной маркировкой белков и образцов позволит проведать прямое сравнение комплексомов в различных патофизиологических, биологических или развивающих состояниях. csBN-MS выполняется на мембранах из мозга грызунов показали огромное разнообразие рецепторов, ионных каналов и транспортеров в отношении их состава подразделения и их функции, и это будет иметь важное значение для анализа 3D структуры в местных препаратов.
