3D-коррелятивное измельчение FIB делает специфические и даже редкие клеточные события доступными для Cryo-TEM. Это позволяет раскрыть ультра-структуру этого события непосредственно в родной среде. Коррелятивный рабочий процесс повышает вероятность успеха нацеливания на редкие клеточные структуры и помогает однозначно идентифицировать их в переполненной клеточной среде.
Процедуру продемонстрируют Анна Бибер и Кристина Капитанио, эксперты в области корреляционной криоэлектронной томографии. Криофлуоресцентную микроскопию засеянных клеток можно начать с получения широкого обзора поля во флуоресцентном и отраженном режимах. Затем выберите подходящие квадраты сетки с флуоресцентным сигналом.
Убедившись, что ячейки и бусины равномерно распределены по направлению к центру каждого квадрата, выберите квадраты на сетке 200 сеток, которые доступны как для инструмента FIB-SEM, так и для TEM, и находятся на расстоянии не менее трех квадратов от края сетки. На каждом из выбранных квадратов сетки приобретите флуоресцентный стек с соответствующим шагом фокусировки. Объективы с высокой числовой апертурой следует использовать для увеличения количества фотонов и точности локализации.
На конфокальном микроскопе с числовой апертурой объектива 0,9 регистрируют стеки с шагом 300 нанометров и передискретизацией значения Найквиста. Записывайте несколько цветовых стопок и храните сетки под жидким азотом до дальнейшего использования. Используйте метки выреза или ориентации, чтобы обеспечить правильную ориентацию сетки для последующего размещения в ПЭМ.
Загрузите сетки в криоприбор FIB-SEM. Убедитесь, что направление фрезерования перпендикулярно оси наклона ПЭМ. Для покрытия решеток защитным металлоорганическим слоем используют плазменный кодер и систему впрыска газа в положениях ступеней, заданных установкой FIB-SEM.
Затем запишите обзор сетки SEM и выполните 2D-корреляцию с обзорами FLM. Найдите квадраты сетки, вручную проверив записанные обзоры сетки или используя пакет программного обеспечения. Выберите и отметьте четыре соответствующих положения для квадратов в обзоре сетки FLM и SEM и рассчитайте трансформацию между отмеченными точками для корреляции FLM-SEM.
Затем поместите маркеры в центр соответствующих квадратов сетки, для которых были получены стеки FLM, прежде чем прогнозировать их положение в представлении SEM. Для каждого коррелированного квадрата сетки возьмите изображение слаботочного ионного пучка под выбранным углом фрезерования FIB и выберите поле зрения с желаемым положением и увеличением, которое соответствует данным флуоресценции. Для сеток с 200 сетками получите данные FIB-SEM, содержащие одиночные квадраты сетки, включая стержни сетки.
Затем сделайте СЭМ-изображение того же квадрата, чтобы помочь идентифицировать соответствующие шарики при просмотре флуоресценции и ионного пучка. Выполните регистрацию необработанного или деконволюльированного стека 3D FLM и вида 2D ионного пучка для каждой позиции с помощью набора инструментов 3D корреляции, 3D CT, загрузив соответствующий перерезанный 3D стек FLM и вид ионного пучка в 3D CT.In данные флуоресценции, выберите четыре реперных шарика и щелкните правой кнопкой мыши по списку положений, чтобы определить 3D-положение шариков с помощью гауссовской аппроксимации сигнала по X, Y и Z.Затем выберите соответствующие шарики на изображении ионного пучка, чтобы выполнить начальную 3D-корреляцию. Точно так же добавьте еще бусин в регистрацию, чтобы проверить точность корреляции.
Исключите некоторые реперные шарики, четко идентифицируемые как во флуоресценции, так и в ионном пучке, сверив их прогнозируемое и фактическое расположение на изображении ионного пучка. В 3D-КТ для оценки согласованности корреляции можно просмотреть среднеквадратичную ошибку или среднеквадратичные значения. Убедитесь, что значения RMSE малы и соответствуют точности локализации.
Затем выберите целевые сотовые сигналы и подгоните 3D-положение в стеке FLM, прежде чем применить преобразование для прогнозирования целевых положений в виде ионного пучка. Для каждого коррелированного квадрата передайте прогнозируемые положения интересующих объектов в инструмент FIB-SEM для размещения шаблонов фрезерования ламелей. Если в ячейке несколько сигналов, разместите шаблоны так, чтобы включить максимально возможные точки интереса в одну и ту же ламель.
Грубая фрезеровка ламелей с последующим тонким фрезерованием для получения конечной толщины от 150 до 250 нанометров. Убедитесь, что ориентация ламели перпендикулярна оси наклона при загрузке сеток в просвечивающий электронный микроскоп. Получите монтаж сетки и обзоры для каждого квадрата сетки, содержащего ламели, с подходящим увеличением и временем экспозиции, чтобы визуализировать реперные шарики на изображениях ПЭМ без значительного увеличения общей дозы электронов.
Получение TEM-карт с высоким разрешением каждой ламели. Приводка и 3D-2D сопоставляют стек FLM с квадратом сетки TEM и обзорами ламелей в 3D CT. Выполните корреляцию между FLM и TEM от низкого до большого увеличения в ПЭМ. После переноса положений настройте и запустите серию наклонов в коррелированных положениях, затем используйте соответствующее увеличение, расфокусировку и общую дозу, чтобы начать получение изображения с предварительного наклона, определяемого ламелем с использованием схемы симметричного наклона дозы.
Выполняйте ручную или пакетную съемку изображений. В репрезентативном анализе показано, что обзор участка измельчения с малым увеличением позволяет локализовать интересующие биологические особенности. Позже более высокое увеличение было соотнесено с проекцией максимальной интенсивности FLM и были установлены позиции для получения томограммы.
На полученных изображениях отложение эндоцитарного белка может быть визуализировано в его родной среде. Оптимизация выборки очень важна. Подготовка сетки должна быть оптимизирована таким образом, чтобы обеспечить хорошее распределение ячеек для измельчения и достаточное количество видимых реперных шариков в большинстве квадратов сетки.
3D-коррелятивное измельчение помогло выявить ультраструктуру различных клеточных процессов, таких как пошаговая прогрессия аутофагии в каждой клетке, и используется для захвата нового компартмента с разделением фаз.
