Здесь мы представляем надежный и простой метод анализа динамики микротрубочек с использованием конфокального изображения живого клеточного спиннингового диска в клетках, синхронизированных в прометафазе, и изображения затем анализируются на платформе на основе MATLAB. Использование красного флуоресцентного белка в сочетании с вращающейся микроскопией диска снижает фототоксичность. Таким образом, большее количество ячеек может быть изображено в рамках той же подготовки.
Динамика микротрубочек изменяется при большом количестве патологических состояний. Таким образом, понимание регулирования и поведения микротрубочек динамики в этих процессах может помочь нам понять механизм заболевания, и в конечном итоге, разработка методов лечения, чтобы компенсировать их. И метод также высококлассный, поэтому он потенциально может быть применен в усилиях по обнаружению наркотиков.
Метод может быть изменен путем изменения протокола флуоресценции десинхронизации и получения клеток из различных фаз клеточного цикла. Это может быть полезно при скрининге препаратов против микротрубочек и выявлении дефектов на делении и неразделения клеток. Необходимо оптимизировать протокол трансфекции и плотность посева для каждого типа клеток.
Уровень экспрессии EB3 должен быть низким, чтобы обнаружить одиночные растущие микротрубоконы. Начните с полоскания асинхронно растущих клеток HeLa в DPBS, а затем инкубировать их трипсином-ЭДТА в течение пяти минут, при 37 градусах по Цельсию. Остановить трипсинизацию, добавив RPMI-1640 среды дополняется 10% тепла инактивированных FCS на три к одному соотношению, добавил трипсин-EDTA.
Рассчитайте концентрацию клеток в соответствии с рукописными указаниями, и семя 50000 клеток в каждом колодец подготовлены, камерные крышки. Вернуть крышку в инкубатор, и расти клетки в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующий день, удалить клетки из инкубатора, и капли мудрый добавить 100 микролитров трансфекции смеси в каждой хорошо.
Вернуть клетки в инкубатор, и после четырех часов инкубации дополнить клетки свежей среде и дополнительно инкубировать в течение 20 часов. Подготовка 2,5 микромоляного раствора диметиленастрона, или DME, в фенол красный свободный DMEM, дополненный 10%FCS и два миллимоляра L-глутамина. Замените среду роста в камерном крышке средой роста DME и верните клетки в инкубатор.
После 3,5 часов инкубации, передать клетки микроскопу путем монтажа камерной крышки в экологическую камеру установлен на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа, с темными панелями для визуализации. Затем продолжайте инкубацию в общей сложности четыре часа. Выполните визуализацию промежуток времени на перевернутом микроскопе с 100X, 1,49 числовой диафрагмой, целью погружения в нефть, двойной дисковой конфокальцаторной системой и надежной системой автофокусировки.
Определите параметры изображения, описанные в текстовой рукописи. Найдите ячейку в профазе и сосредоточьтесь в плоскости, соответствующей центру монополярного митотического шпинделя. Затем приобретайте изображения каждые 5 секунд, в общей сложности одну минуту, без биннинга и без освещения между экспозициями.
Начните с загрузки программного обеспечения для численного анализа и добавления папки V2.2.0 u-track в путь поиска программного обеспечения, называемый графическим интерфейсом селектора фильмов, из окна команды. Затем импортируют необработанные файлы, генерируемые программным обеспечением для получения изображений. Вручную введите численную диафрагму цели и интервал времени, используемый для визуализации.
После загрузки всех изображений сохраните введенную серию промежуток времени в качестве фильма, выбрав сохранить в качестве списка фильмов, и u-трек вариант на правой стороне окна диалога. Выберите микротрубокон плюс-концы из всплывающего меню и нажмите кнопку ok, которая открывает новое окно диалога для определения параметров трех этапов анализа. Для шага один, нажмите настройки и выберите обнаружение кометы из меню падения вниз.
Определите параметры разницы гауссийского фильтра и сегментации водораздела, как описано в рукописи. Затем выберите применить настройки ко всем фильмам и нажмите применить. Для второй шага выберите динамику микротрубочек плюс конец и используйте параметры настройки для определения значений ссылок, закрытия разрыва, слияния и разделения, а также функций фильтра Kalman, согласно рукописи текста.
Для проблем с размерностью, выберите два из меню падения вниз, и использовать пять кадров для максимального разрыва, чтобы закрыть, и три кадра для минимальной длины трек сегментов с первого шага. Как и прежде, выберите применить настройки для всех фильмов и нажмите применить. Для третий шаг выберите классификацию динамики микротрубочек в качестве метода анализа трека и определите параметры с помощью кнопки настройки.
Выберите ящики для удаления треков в начале и конце фильма и сделайте статистику гистограмм. Из списка падения выберите два-три кадра до разрыва вперед и 95-й процентиль распределения скорости вперед для реклассификации вперед и назад соответственно. После того, как все параметры определены, выберите применить проверку / uncheck для всех фильмов, и запустить все фильмы коробки из окна управления панелей u-трек, а затем нажмите запустить.
Сообщение отображается после завершения обработки фильма. Плазмида pEB3-tdTomato была временно выражена в клетках HeLa. Клетки были синхронизированы с лечением DME.
Были проанализированы покадровые фильмы роста микротрубочек, а также наметилась полученная скорость и динамичность роста. Параметры, описанные для анализа, такие как максимальная длина разрыва и максимальный коэффициент усадки, были изменены для одного и того же набора фильмов с промежуток времени. Были рассчитаны соответствующие значения скорости роста и динамики.
Хотя полученная в результате этого скорость роста не была существенно затронута, динамика была иной, когда была изменена максимальная длина разрыва. Во всех трех случаях обнаружение микротрубочек было аналогичным, однако реконструкция всех траекторий МТ в основном была затронута, когда максимальная длина разрыва была установлена до 15. Для оценки того, мешали ли условия визуализации поведению микротрубочек, была отдельно проанализирована первая и вторая половины временных рядов, и были сопоставлены соответствующая скорость и динамика роста.
Как и ожидалось, существенных различий обнаружено не было. Важно иметь в виду, что, поскольку клетки синхронизированы в прометафазе, плотность микротрубочек очень высока. Поэтому необходимо очень тщательно устанавливать параметры анализа, чтобы не ошибиться в различных микротрубочках.
Измерение динамики микротрубочек с помощью этого метода можно сравнить с исследованиями других биологических целей прямо, косвенно, регулирующих микротрубоконы.
