Болезнь Гентингтона, БГ, является неизлечимой, нейродегенеративной патологией, вызванной мутацией в гене, кодирующем белок гентингтина. Гентингтин в первую очередь связан с везикулами и микротрубочками и, вероятно, участвует в процессах переноса, зависящих от микротрубочек. Для изучения влияния мутантного гентингтина на динамизм микротрубочек мы использовали визуализацию in vivo белка EB3, который регулирует динамические свойства микротрубочек путем изгиба и стабилизации растущих плюс-эндов.
Чтобы загрузить флуоресцентно меченый EB3 в фибробласты кожи человека, мы применили трансфекцию плазмид. Мы использовали первичную культуру фибробластов для получения биопсии кожи пациента с EB3 для этого исследования. Доставьте биопсию в лабораторию в течение нескольких часов в среде DMEM, дополненной 15 микрограммом на миллилитр пенициллина и 50 единицами на миллилитр стрептомицина.
Поместите биопсию ткани в шестисантиметровую чашку Петри вместе с небольшим количеством среды. Используя стерильный скальпель, разрежьте образец биопсии на кусочки размером от 0,5 до одного миллиметра. Поместите один, два, полученных фрагмента в чашку Петри размером 3,5 сантиметра, а поверх кусочков биопсии поместите стерильную крышку.
Медленно добавляют 1,5 миллилитра питательной среды. Культивируйте волокнистые слоисты в питательной среде в CO2-инкубаторе, в 5% CO2, что составляет семь градусов по Цельсию, влажность 80%. Через четыре, семь дней сначала кератиноциты, затем фибробласты начинают мигрировать из ткани на дно тарелки.
Культивирование клеток. Для трансфекционной визуализации следует использовать стеклянные конфокальные тарелки, конфокальные тарелки. Накройте дно тарелки автоклавным 0,1% раствором желатина, приготовленным в дистиллятной воде.
Инкубировать в течение 15 минут. Подготовьте культуральную среду. Тщательно перемешайте, храните при температуре плюс 4 по Цельсию.
Нагрейте среду до плюс 37 по Цельсию, прежде чем добавлять в клетки. Оцените культуру под микроскопом. Удалите среду и промойте клетки стерильным DPBS.
Добавьте в клетки один миллилитр предварительно подогретого 0,25% раствора трипсина. Проверьте клетки под микроскопом, если они полностью отсоединяются от подложки. Деактивировать трипсин одним миллилитром питательной среды.
Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Центрифугируйте трубку при 200 G в течение пяти минут. Удалите супернатант, повторно суспендируйте клеточную палитру в одном миллилитре питательной среды.
Подсчитайте номер ячейки. Рассчитайте необходимое количество ячеек. Сеяют их с плотностью от восьми до 15, умножают на 10 в степени трех, проходят на сантиметр.
Его панируют в миллилитрах питательной среды. Вынуть желатиновый раствор из культуральной посуды, подготовленной для посева, и сразу же добавить два миллилитра клеточной суспензии. Культивируйте фибробласты при температуре плюс 37 градусов по Цельсию в CO2-инкубаторе.
Обновляйте среду каждые два, четыре дня. Для экспериментов используют клетки из четырех, 11 проходов. К моменту трансфекции слияние должно составлять не более 70,80% Заменить питательную среду свежей за 24 часа до трансфекции.
Готовят ДНК-липидный комплекс, исходя из площади и плотности посева клеток. Использовался липосомальный трансфекционный агент, а плотность посева клеток одной, умноженной на 10 до степени четырех клеток, пройденных на сантиметр. Добавьте три микролитра коммерческого реагента к 125 микролитрам Opti-MEM, не содержащим антибиотика.
Не касаясь стенок трубки, аккуратно повторно суспендировать. Разбавляют плазмидную ДНК, GFP-EB3, добавляя один микрограмм плазмидной ДНК к 125 микролитрам OptiMEM. Осторожно повторно суспендировать.
Добавьте разбавленную плазмидную ДНК в каждую пробирку разбавленного трансфекционного реагента в соотношении один к одному. Инкубировать в течение 30 минут. Добавьте липидный комплекс ДНК в шестисантиметровую чашку Петри с клетками.
Перемешайте крестообразным взмахом в течение 30 секунд. Инкубировать клетки с трансфекционным агентом в течение 24 часов, затем изменить среду на свежую. Анализ эффективности после осмотра через 24 и 48 часов.
Подготовка к визуализации. Перед живой визуализацией клеток измените культуральную среду на среду без индикаторного красителя PH, чтобы уменьшить автофлуоресценцию. Осторожно нанесите минеральное масло на среднюю клеточную фазу, чтобы полностью покрыть среду, изолируя ее от внешней среды, чтобы уменьшить проникновение O2 и испарение среды.
Используйте макролампу и все изображение в 60-кратном, 100-кратном объективе с высокой цифровой диафрагмой для получения изображения. Для наблюдений в viva микроскоп должен быть оснащен инкубатором для поддержания необходимых условий для клеток, включая попадание в оптический стол, и линзой, чтобы пройти 37 градусов по Цельсию, закрытая камера была подачей CO2 и поддержкой уровня влажности. Поместите конфокальную чашку с клетками в держатель микроскопа перед визуализацией.
Убедитесь, что тарелка и камера надежно прикреплены к держателю, чтобы избежать дрейфа во время съемки. Настройка параметров изображения. Выбирайте низкие значения экспозиции, так как скольжение вызывает повреждение клеток, реагирует с кислородными пространствами.
Для изучения динамики микротрубочек в фибробластах кожи человека мы выбрали экспозицию 300 миллисекунд. Сосредоточьтесь на интересующем объекте. Для длительной, покадровой съемки необходима система автоматической стабилизации фокусировки, идеальная система фокусировки, так как может произойти сдвиг вдоль заданной оси, и интересующий объект таким образом окажется вне фокуса.
Выберите оптимальные условия визуализации в зависимости от светочувствительности клетки и скорости затухания бликового хрома. Поскольку микротрубочки являются высокодинамичными структурами, то достаточно короткое время в свою очередь можно выбрать, а частота кадров должна быть достаточно высокой. Чтобы исследовать динамику микротрубочек в фибробластах кожи, мы использовали частоту один кадр в секунду, в течение трех, пяти минут.
При выборе следующего объекта для получения изображения отойдите от уже изображенной области, так как под воздействием света происходит затухающее фотопролитие. Поскольку мы использовали относительно высокую частоту изображения, затвор не закрывался между изображениями, и лампа опаздывала на весь период съемки, который при затухании увеличивался. Выбрать оптимальные видеоролики для визуального изучения динамики микротрубочек с учетом качества трансфекции, качества изображений микротрубочек, оптимального отношения сигнал/шум и отсутствия дрейфа анализируемой ячейки.
Используйте выбранные видеоролики для изучения динамики микротрубочек плюс-эндов, путем их стропания в программе Фиджи. Наиболее важным этапом в протоколе является трансфекция, обеспечивающая достаточную экспрессию белка. Хорошее соотношение сигнал/шум, отсутствие фотоотбеливания микротрубочек и отсутствие дрейфа клеток имеют решающее значение для визуализации.
Визуализация in vivo динамики микротрубочек дает жизненно важную информацию о свойствах мутантного гентингтина. Наш протокол может быть применен к исследованиям других заболеваний, патология которых подразумевает динамические свойства цитоскелета.
