Внутриклеточные бактерии выделяет белки эффектора в хозяина, который может манипулировать биологическими путями для содействия выживанию патогенов. Выявление принимающих целей эффекторов имеет важное значение для понимания внутриклеточных патогенов, таких как chlamydia trachomatis. Дрожжи токсичности и супрессор экраны могут обеспечить ключевое понимание в отношении естественной биологической цели бактериальных белков эффектора и может быть особенно полезным, когда связывающий партнер неизвестен.
Мы демонстрируем токсичность дрожжей и супрессор анализы здесь для скрининга на хламидиоз trachomatis эффектор белков, но этот метод также был использован для характеристики Legionella пневмофилы и Coxiella burnetii эффекторов. Начните с инокуляции пяти миллилитров одного выпадают бульона с одной колонией дрожжей, преобразованных с эффектором белка, содержащего плазмиду. Используйте дрожжи преобразованы с вектором только в качестве отрицательного контроля и инкубировать инокулум ночь при 30 градусах по Цельсию во время встряхивания.
На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в скважины A2 через скважины A6 из 96 скважин. Vortex ночной культуры и добавить 180 микролитров дрожжей хорошо A1. Затем последовательно разбавляют дрожжи в колодцах водой. Используйте многоканарный пипетку, чтобы обнаружить пять микролитров каждого разбавления на одну выпавку глюкозы и одиночные выпавные галактозные агарные пластины и инкубировать пластины при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов.
После инкубации, визуально оценить токсичность, сравнивая рост дрожжей, выражающих эффектор белка, выращенного на галактозсодержащих средств массовой информации для роста дрожжей, выражающих вектор в одиночку. Прививите 100 миллилитров одного выпавного бульона одним миллилитром ранее приготовленного дрожжевого бульона и инкубировать его в течение 16-24 часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании при 150 об/мин. На следующий день добавьте все 100 миллилитров ночной культуры в 900 миллилитров предварительно разогретого бульона и инкубировать колбу в течение четырех-пяти часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании.
После инкубации гранулы культуры в 6000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 250 миллилитров стерильной воды. Повторите центрифугу и отбросьте супернатант.
Затем повторно посовестите гранулы в 250 миллилитров одного миллимолярского литиевого ацетата. Пеллет культуры центрифугации, удалить ацетат лития, и повторно гранулы в 9,6 миллилитров 50%PEG 3350. Затем добавьте реагенты преобразования, описанные в рукописи, и отрегулируйте громкость до 15 миллилитров со стерильной водой, аккуратно переверкуемой для смешивания.
Инкубировать смесь при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Затем добавьте 750 микролитров DMSO и инкубировать в водяной бане при 42 градусах по Цельсию еще 30 минут. Добавление DMSO до теплового удара имеет решающее значение для достижения высокой эффективности трансформации.
После инкубации, гранулы дрожжей центрифугирование на 3000 раз г в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и промыть гранулы с 10 миллилитров стерильной воды затем повторить центрифугации гранул дрожжей. Переусейте гранулы в восьми миллилитров воды.
Определите эффективность преобразования путем разбавления образца от одного до 10 и покрытия 100 микролитров каждого разбавления на двойной выпадают агар. Затем пластины 200 микролитров образца на двойной отсева галактозы агар пластин и инкубировать пластины при 30 градусов по Цельсию в течение 48 до 96 часов или до тех пор, пока колонии появляются. После того, как колонии появились, патч их на двойной отсева галактозы агар и инкубировать их еще на 24 до 48 часов.
Используйте часть патча, чтобы привить пять миллилитров двойного выпадают бульона и инкубировать инокулум на ночь при 26 градусах по Цельсию со тряской при 150 об/мин. На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в пять колодцев пластины из 96 скважин, начиная с колодца А2. Vortex ночь культуры смеси. Добавьте 180 микролитров дрожжей в скважину А1 и последовательно разбавляйте его водой в колодцах А2 через А6. Пятно пять микролитров каждого разбавления на одной отсева глюкозы и одного отсева галактозы агар пластин убедившись, что включить токсичный эффектор только в качестве контроля.
Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 48 часов, а затем сравнить рост дрожжей с токсичным эффектором только для роста дрожжей с потенциальным супрессором. Чтобы подтвердить супрессоры, которые продемонстрировали снижение токсичности по сравнению с токсичным эффектором в одиночку, изолировать плазмид в соответствии с рукописными направлениями и вновь превратить его в токсичные дрожжи. Прививка двойного отсева глюкозного бульона с колонией из трансформационной пластины.
Инкубировать его на ночь и пятно на двойной отсева глюкозы и галактозы агар, чтобы подтвердить подавление токсичности. Перед выполнением дрожжевой супрессор экран, эффектор белков, представляющих интерес были протестированы на токсичность в дрожжах. Интерес к белку выражался в дрожжах под контролем неуязвимого промоутера галактозы, а рост галактозы сравнивали с ростом глюкозы.
Когда CT229 был протестирован на токсичность, небольшие колонии и подавление роста наблюдались. В идеале, два-три журнала снижение следует наблюдать, чтобы приступить к дрожжевой супрессор экранов. Экран супрессора был проведен путем преобразования токсичного штамма с дрожжевой геномной библиотекой pYAP 13 и покрытием трансформантов на галактозном агаре.
Полученные клоны супрессора были замечены на двойном выбросе галактозного агара для подтверждения подавления токсичности. Супрессоры pSup1 и pSup2 подавляли токсичность белка-эффектора, в то время как pSup3 - нет. Эти процедуры требуют тщательного внимания к деталям в дополнение к критическим подготовительным работам, включая наличие большого количества средств массовой информации и пластин, готовых до проведения эксперимента.
После того, как супрессоры определены, эксперименты могут быть выполнены для проверки взаимодействия с эффектором интереса, включая тянуть падения, иммунофторесценции колокализации, эффектор нокаутом или нокдаун принимающих факторов, выявленных на экранах. Разработка этого метода для эффекторов хламидиоза позволила ускорить предварительную характеристику белков-эффекторов и помогла сосредоточить наши усилия на выяснении основных молекулярных механизмов, которые являются посредниками взаимодействия патогенов-хозяйцев.
