細胞内細菌は、病原体の生存を促進するために生物学的経路を操作することができる宿主にエフェクタータンパク質を分泌する。クラミジア・トラコマティスのような細胞内病原体を理解するためには、エフェクターの宿主標的を明らかにすることが不可欠である。酵母毒性およびサプレッサースクリーンは、細菌エフェクタータンパク質の自然な生物学的標的に関する重要な洞察を提供することができ、結合パートナーが不明な場合に特に有用であり得る。
クラミジア・トラコマティス・エフェクタータンパク質のスクリーニング用の酵母毒性およびサプレッサーアッセイをここで実証していますが、レジオネラ・ニューモフィラやコクシエラ・ブレネチエフェクターの特性化にも使用されています。プラスミドを含むエフェクタータンパク質で形質転換した酵母の単一コロニーで5ミリリットルの単一ドロップアウトスープを接種することから始めます。ベクター単独で形質転換した酵母を陰性対照として使用し、振りながら摂氏30度で一晩接種をインキュベートする。
翌日、96ウェルプレートのA6ウェルを通してA2に180マイクロリットルの無菌水を加えます。一晩培養をボルテックスし、180マイクロリットルの酵母をA1に加える。その後、水で井戸中の酵母を連続して希釈します。マルチチャンネルピペットを使用して、各希釈液の5マイクロリットルをシングルドロップアウトグルコースとシングルドロップアウトガラクトース寒天プレートにスポットし、プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。
インキュベーション後、ガラクトース含有培地上で増殖したエフェクタータンパク質を発現する酵母の増殖を、ベクター単独で発現する酵母の増殖と比較して、毒性を目視で評価する。100ミリリットルの単一の脱落したスープを、以前に調製した酵母ストックの1ミリリットルで接種し、150 RPMで振ると摂氏30度で16〜24時間インキュベートします。翌日、一晩培養した100ミリリットル全体を900ミリリットルの温めた単一ドロップアウトスープに加え、揺れながら30°Cで4~5時間フラスコをインキュベートします。
インキュベーション後、6,000倍gで4度で10分間培養をペレット化する。上清を捨て、250ミリリットルの滅菌水でペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。
その後、酢酸リチウム1ミリモルの250ミリリットルでペレットを再懸濁する。ペレットは遠心分離により培養し、酢酸リチウムを除去し、ペレットを50%PEG3350の9.6ミリリットルで再懸濁した。次に、原稿に記載されている形質転換試薬を加え、滅菌水を穏やかに反転して15ミリリットルに調整して混合します。
30°Cで30分間インキュベートします。その後、750マイクロリットルのDMSOを加え、さらに30分間摂氏42度の水浴でインキュベートします。高い変換効率を達成するには、ヒートショックの前にDMSOを追加することが重要です。
インキュベーション後、5分間3,000回gで遠心分離機で酵母をペレット化する。上清を捨て、10ミリリットルの滅菌水でペレットを洗い、遠心分離を繰り返して酵母をペレット化します。ペレットを8ミリリットルの水に再び懸濁します。
サンプル1~10を希釈し、各希釈液の100マイクロリットルを二重脱落寒天にめっきすることにより、変換効率を決定します。その後、サンプル200マイクロリットルを二重脱落ガラクトース寒天プレートにプレートし、48〜96時間、またはコロニーが現れるまで摂氏30度でプレートをインキュベートする。コロニーが出現したら、二重中退ガラクトース寒天にパッチを当て、さらに24〜48時間インキュベートします。
パッチの一部を使用して、5ミリリットルの二重脱落スープを接種し、150 RPMで振って摂氏26度で一晩接種をインキュベートします。翌日、180マイクロリットルの無菌水を、A2から始まる96ウェルプレートの5つの井戸に加えます。一晩の培養ミックスを渦。180マイクロリットルの酵母をA1に加え、A2からA6までの井戸の水を使用して連続して希釈します。単一のドロップアウトグルコースとシングルドロップアウトガラクトース寒天プレートに各希釈液の5マイクロリットルを見つけ、毒性エフェクターを単独でコントロールとして含めます。
プレートを摂氏30度で48時間インキュベートし、有毒エフェクターだけで酵母の成長を潜在的なサプレッサーを有する酵母の成長と比較する。毒性エフェクター単独と比較して減少した毒性を示したサプレッサーを確認するには、原稿の指示に従ってプラスミドを分離し、有毒酵母に再変換する。二重脱落したグルコーススープを、変質プレートからコロニーで接種する。
一晩インキュベートし、二重中退グルコースとガラクトース寒天にスポットを当て、毒性の抑制を確認します。酵母サプレッサースクリーンを実施する前に、目的のエフェクタータンパク質が酵母における毒性について試験された。目的のタンパク質をガラクトース誘導促進剤の制御下で酵母で発現させ、ガラクトース上での増殖をグルコース上での増殖と比較した。
CT229が毒性について試験された場合、より小さいコロニーおよび増殖抑制が観察された。理想的には、酵母サプレッサースクリーンを進めるために2〜3ログ減少を観察する必要があります。サプレッサースクリーンは、酵母ゲノムライブラリーpYAP13で有毒株を変容させ、ガラクトース寒天に変質剤をめっきすることにより行った。
得られたサプレッサークローンを、毒性の抑制を確認するために二重脱落ガラクトース寒天で発見した。サプレッサーpSup1およびpSup2はエフェクタータンパク質の毒性を抑制したのに対し、pSup3は抑制しなかった。これらの手順では、実験を行う前に大量のメディアやプレートを準備するなど、重要な準備作業に加えて、細部まで細心の注意を払う必要があります。
サプレッサーが特定されると、プルダウン、免疫蛍光共局在、エフェクターノックアウト、またはスクリーンで特定されたホスト因子のノックダウンを含む目的のエフェクターとの相互作用を検証する実験を行うことができます。クラミジアエフェクターのためのこの技術の開発は、エフェクタータンパク質の迅速な予備的な特徴付けを可能にし、宿主病原体相互作用を媒介する基礎的な分子メカニズムの解明に焦点を当てるのに役立ちました。
