Hücre içi bakteriler, patojen sağkalımını teşvik etmek için biyolojik yolları manipüle edebilen konak içine efektör proteinlersalgılar. Chlamydia trachomatis gibi hücre içi patojenlerin anlaşılması için etki cisim hedeflerinin ortaya çıkması esastır. Maya toksisitesi ve bastırıcı ekranlar bakteriyel efektör proteinlerin doğal biyolojik hedefi ile ilgili anahtar fikir sağlayabilir ve bağlayıcı bir ortak bilinmiyor sayılsa da özellikle yararlı olabilir.
Biz klamidya trachomatis efektör proteinler için tarama için burada maya toksisitesi ve bastırıcı tahliller göstermek, ama bu teknik de Legionella pnömofili ve Coxiella burnetii etkileri karakterize etmek için kullanılmıştır. Plazmid içeren efektör proteinile dönüştürülmüş tek bir maya kolonisi ile tek damla suyu beş mililitre aşılayarak başlayın. Negatif kontrol olarak tek başına vektör ile dönüştürülmüş maya kullanın ve sallayarak 30 derece santigrat gecede incubate.
Ertesi gün, 96 kuyulu bir plakanın A6 kuyuları aracılığıyla A2'ye 180 mikrolitre steril su ekleyin. Vortex gecede kültür ve iyi A1 maya 180 mikrolitre ekleyin. Sonra seri su ile kuyularda maya seyreltin. Tek damla glikoz ve tek drop-out galaktoz agar plakaları üzerine her seyreltme beş mikrolitre nokta ve 48 saat boyunca 30 santigrat derece plakaları kuluçka için çok kanallı pipet kullanın.
Kuluçkadan sonra, galaktoz içeren ortam üzerinde yetişen efektör proteini ifade eden mayanın büyümesini, vektörü tek başına ifade eden mayanın büyümesi ile karşılaştırarak toksisiteyi görsel olarak değerlendirin. 100 mililitrelik tek damla suyu, önceden hazırlanmış maya stokunun bir mililitresi ile aşıla ve 150 RPM'de sallayarak 30 santigrat derecede 16 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, gece kültürünün tüm 100 mililitre sini 900 mililitre önceden ısıtılmış tek bırakma suyu ekleyin ve şişeyi 30 santigrat derecede 4-5 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 6,000 kez g'de kültürü peletleyin. Supernatant atın ve steril su 250 mililitre pelet resuspend. Santrifüjtekrar layın ve supernatant atın.
Sonra bir milimolar lityum asetat 250 mililitre pelet resuspend. Santrifüj ile kültür pelet, lityum asetat kaldırmak ve% 50 PEG 3350 9,6 mililitre pelet resuspend. Daha sonra el yazmasında açıklandığı gibi dönüşüm reaktifleri ekleyin ve hacmi 15 mililitreye ayarlayın ve steril su yavaşça karıştırarak ters çevirin.
Karışımı 30 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra dmso 750 mikrolitre ekleyin ve başka bir 30 dakika için 42 santigrat derece bir su banyosu nda kuluçka. Yüksek dönüşüm verimliliği elde etmek için DMSO'nun ısı şokundan önce eklenmesi çok önemlidir.
Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 3,000 kez g santrifüj ederek maya pelet. Supernatant atın ve steril su 10 mililitre ile pelet yıkayın sonra maya pelet için santrifüj tekrarlayın. Peleti sekiz mililitre suda tekrar askıya alın.
Numuneyi 1'den 10'a kadar seyrelterek dönüşüm verimliliğini belirleyin ve her seyreltmenin 100 mikrolitresini çift damla-out agar üzerine kaplama. Daha sonra numunenin 200 mikrolitresini çift açılır galaktoz agar plakasına koyun ve plakaları 48 ila 96 saat veya koloniler ortaya çıkana kadar 30 derecede kuluçkaya yatırın. Koloniler ortaya çıktıktan sonra, onları çift açılır galaktoz agar'a yamalayın ve 24 ila 48 saat daha kuluçkaya yatırın.
Beş mililitre çift açılır et suyu aşılamak ve inoculumu bir gecede 26 santigrat derecede 150 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırmak için yamanın bir kısmını kullanın. Ertesi gün, iyi A2 ile başlayan 96 kuyulu bir plaka beş kuyuya steril su 180 mikrolitre ekleyin. Girdap gece kültür karışımı. Iyi A1 maya 180 mikrolitre ekleyin ve seri a2 ile A6 kuyularında su kullanarak seyreltin. Tek damla glikoz ve tek drop-out galaktoz agar plakaları üzerinde her seyreltme Nokta beş mikrolitre tek başına bir kontrol olarak toksik efektör dahil emin olun.
48 saat boyunca 30 santigrat derece plakaları kuluçka ya da potansiyel bastırıcı ile maya büyüme tek başına toksik efektör ile maya büyümesini karşılaştırın. Sadece toksik etki yle karşılaştırıldığında azalmış toksisite gösteren bastırıcıları doğrulamak için, plazmidi el yazması yönlere göre izole edin ve toksik mayaya yeniden dönüştürün. Dönüşüm plakasından bir koloni ile çift damla glikoz suyu aşılamak.
Bir gecede kuluçkaya yatırın ve toksisitenin bastırılmasını doğrulamak için çift damla glikoz ve galaktoz agar üzerinde nokta. Maya bastırıcı ekran gerçekleştirmeden önce, ilgi efektör proteinler maya toksisite için test edildi. İlgi proteini bir galaktoz indükleyici kontrolü altında maya ifade edildi ve galaktoz büyüme glikoz büyüme ile karşılaştırıldı.
CT229 toksisite testi yapıldığında, daha küçük koloniler ve büyüme baskılanması gözlendi. İdeal olarak, maya bastırıcı ekranlar ile devam etmek için bir iki ila üç günlük azalma gözlenmelidir. Bastırıcı ekran, maya genomik kütüphane pYAP 13 ile toksik suşun dönüştürülmesi ve galaktoz agar üzerindeki transformatörlerin boyanması ile gerçekleştirilmiştir.
Elde edilen bastırıcı klonlar toksisite bastırılması onaylamak için çift drop-out galaktoz agar tespit edildi. Bastırıcılar pSup1 ve pSup2 efektör proteinin toksisitesini bastırırken pSup3 bunu yapmadı. Bu yordamlar, denemeyi gerçekleştirmeden önce büyük miktarda ortam ve plakanın hazır olması da dahil olmak üzere kritik hazırlık çalışmalarına ek olarak ayrıntılara dikkat etmeyi gerektirir.
Bastırıcılar tanımlandıktan sonra, çekme inmeleri, immünoreskence kolokalizasyonu, efektör nakavt veya ekranlarda tanımlanan konak faktörlerinin nakavt ı dahil olmak üzere ilginin etkisiyle etkileşimleri doğrulamak için deneyler yapılabilir. Klamidya efektörleri için bu tekniğin geliştirilmesi, efektör proteinlerin ön karakterizasyonunun hızlandırılmasına olanak sağladı ve patojen etkileşimlerine aracılık eden altta yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik çabalarımızı odaklamaya yardımcı oldu.
