세포 내 박테리아는 병원체 생존을 촉진하기 위해 생물학적 경로를 조작 할 수있는 숙주로 이펙터 단백질을 분비합니다. 이펙터의 호스트 표적을 드러내는 것은 클라미디아 trachomatis 같이 세포내 병원체를 이해하는 데 필수적입니다. 효모 독성 및 억제기 스크린은 세균성 이펙터 단백질의 자연적인 생물학적 표적에 관하여 중요한 통찰력을 제공할 수 있고 결합 파트너가 알려지지 않을 때 특히 유용할 수 있습니다.
우리는 클라미디아 트라코마티스 이펙터 단백질을 선별하기 위해 효모 독성 및 억제기 애법을 여기에서 입증하지만,이 기술은 또한 레지오넬라 폐렴과 콕시엘라 burnetii 이펙터를 특성화하는 데 사용되었습니다. 플라스미드를 함유한 이펙터 단백질로 변형된 효모의 단일 콜로니와 함께 단일 드롭아웃 국물의 5밀리리터를 접종하는 것으로 시작합니다. 벡터로 만 변형된 효모를 음의 제어로 사용하고 흔들면서 밤새 접종을 30도에서 배양합니다.
다음 날, 96웰 플레이트의 A6 우물을 통해 A2에 멸균 수분 180마이크로리터를 넣습니다. 하룻밤 문화를 소용돌이고 잘 A1에 효모의 180 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 우물에서 효모를 물로 일렬로 희석시합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 희석제 5개의 마이크로리터를 단일 드롭아웃 포도당과 단일 드롭아웃 갈라토세 한정식 에마천 플레이트에 발견하고 48시간 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.
인큐베이션 후, 갈라토세 함유 매체에서 자란 이펙터 단백질을 발현하는 효모의 성장을 단독으로 발현하는 효모의 성장에 비유하여 독성을 시각적으로 평가한다. 이전에 준비된 효모 육수의 1밀리리터로 단일 드롭아웃 국물의 100밀리리터를 접종하고 150 RPM에서 흔들림과 함께 섭씨 30도에서 16~24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 밤새 문화의 전체 100 밀리리터를 900 밀리리터에 미리 데워진 싱글 드롭 아웃 국물의 900 밀리리터를 추가하고 흔들리는 동안 섭씨 30도에서 4 ~ 5 시간 동안 플라스크를 배양합니다.
인큐베이션 후, 4섭씨에서 10분 동안 6, 000배g의 배양식을 펠릿합니다. 상체를 버리고 250 밀리리터의 멸균물로 펠릿을 다시 분리하십시오. 원심분리를 반복하고 상체를 폐기합니다.
그런 다음 1 밀리머 리튬 아세테이트의 250 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 원심분리에 의한 배양을 펠렛, 리튬 아세테이트 제거, 펠릿을 50%PEG 3350의 9.6 밀리리터로 재보페한다. 그런 다음 원고에 설명된 바와 같이 변환 시약을 추가하고 혼합부드럽게 반전멸균수와 15 밀리리터에 볼륨을 조정합니다.
30 분 동안 섭씨 30도에서 혼합물을 배양하십시오. 그런 다음 750 마이크로리터의 DMSO를 추가하고 또 다른 30 분 동안 섭씨 42도에서 수조에 배양하십시오. 열 충격 전에 DMSO를 추가하는 것은 높은 변환 효율성을 달성하는 데 매우 중요합니다.
인큐베이션 후, 5 분 동안 3, 000 배 g에서 원심 분리하여 효모를 펠릿. 상체를 버리고 펠릿을 멸균물 10밀리리터로 씻은 다음 원심분리기를 반복하여 효모를 펠릿합니다. 8밀리리터의 물에서 펠릿을 다시 놓습니다.
샘플을 1에서 10으로 희석하고 각 희석제의 100 마이크로리터를 이중 드롭아웃 한고에 도금하여 변환 효율성을 결정합니다. 그런 다음 이중 드롭 아웃 갈라콘토제 한천 접시에 샘플의 200 마이크로 리터를 판과 48 ~ 96 시간 동안 또는 식민지가 나타날 때까지 섭씨 30도에서 플레이트를 배양. 식민지가 나타나면, 이중 드롭 아웃 갈라콘토제 한천에 패치하고 또 다른 24 ~ 48 시간 동안 배양.
패치의 일부를 사용하여 더블 드롭 아웃 국물의 5 밀리리터를 접종하고 150 RPM에서 흔들림과 함께 섭씨 26도에서 밤새 접종을하십시오. 다음 날, 잘 A2로 시작하는 96 웰 플레이트의 5 개의 우물에 멸균 물 180 마이크로 리터를 추가합니다. 하룻밤 문화 믹스소용돌이. 잘 A1에 효모의 180 마이크로 리터를 추가하고 A6를 통해 우물 A2의 물을 사용하여 연속적으로 희석. 단일 드롭 아웃 포도당과 단일 드롭 아웃 갈라토제 한정식 한도 에 각 희석의 5 마이크로 리터를 발견 대조군으로 혼자 독성 이펙터를 포함 되도록.
48시간 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양한 다음 효모의 성장을 독성 이펙터와 단독으로 비교하여 효모의 성장과 잠재적 억제제와 비교합니다. 독성 이펙터에 비해 독성이 감소된 것을 확인하기 위해 원고 지시에 따라 플라스미드를 분리하고 독성 효모로 재변환한다. 변환 플레이트에서 식민지와 함께 이중 드롭 아웃 포도당 국물을 접종.
하룻밤 동안 배양하고 독성 억제를 확인하기 위해 이중 드롭 아웃 포도당과 갈라토세 한고에 자리. 효모 억제기 화면을 수행하기 전에, 관심의 이펙터 단백질은 효모의 독성에 대해 테스트되었다. 관심의 단백질은 갈라토제 유도 촉진제의 통제하에 효모에서 발현되었고 갈라토스의 성장은 포도당에 대한 성장과 비교되었다.
CT229가 독성검사를 받았을 때, 더 작은 식민지와 성장 억제가 관찰되었다. 이상적으로는 효모 억제기 화면을 진행하기 위해 2~3개의 로그 감소를 관찰해야 합니다. 억제기 스크린은 효모 게놈 라이브러리 pYAP 13을 사용하여 독성 변형을 변형시키고 갈라토세 한고에 변압제를 도금하여 수행하였다.
얻어진 억제제 클론은 독성 억제를 확인하기 위해 이중 드롭 아웃 갈라토세 한고에서 발견되었다. 억제제 pSup1 및 pSup2는 pSup3이 아닌 반면 이펙터 단백질의 독성을 억제했다. 이러한 절차는 실험을 수행하기 전에 많은 양의 미디어와 플레이트를 준비하는 것을 포함하여 중요한 준비 작업 외에도 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다.
억제제가 확인되면 화면에서 확인된 호스트 인자의 풀다운, 면역 형광 공존성, 이펙터 녹아웃 또는 넉다운을 포함한 관심있는 이펙터와의 상호 작용을 검증하기 위한 실험을 수행할 수 있습니다. Chlamydia 이펙터를 위한 이 기술의 개발은 이펙터 단백질의 신속한 예비 특성화를 허용하고 호스트 병원체 상호 작용을 중재하는 근본적인 분자 기계장치를 해명하는 데 우리의 노력을 집중하는 것을 도왔습니다.
