Мы объединяем микродиссекцию лазерного захвата с протоколом поиска одноклеточной РНК под названием CEL-Seq2 для создания наборов транскриптомных данных для небольших отдельных образцов тканей. Этот метод позволяет изучать экспрессию генов в тканях или видах, которые не могут быть изучены с использованием традиционных методов сортировки клеток. Кроме того, он обеспечивает большую специфичность, чем объемный подход RNA-seq.
Здесь мы продемонстрировали эту технику для четырехклеточных кончиков хвоста самцов четвертой личиночной стадии C.elegans и гермафродитов. Но прелесть такого подхода в том, что его можно применить даже к немодельным видам. Продемонстрировать процедуру будут г-жа Райя Джаллад, аспирант из моей лаборатории, и доктор Антонио Эррера, в настоящее время ведущий биомедицинский ученый в школе Бейлора в Чаттануге, штат Теннесси.
Начните с осторожной пипетки от одного до двух миллилитров буфера M9 о стенку пластины без брызг. Закрутите пластину, чтобы выбить червей. Удалите и выбросьте всю жидкость и червей, приложив кончик пипетки к стенке пластины на краю агара, чтобы избежать протыкания отверстий.
На этом видео показана пластина перед удалением матерей и личинок. После удаления матерей и личинок следует оставлять только эмбрионы. Личинка L1 начнет появляться после инкубации в течение часа или около того.
Затем поместите пластину при температуре 25 градусов по Цельсию. Через час снимите пластину с инкубатора. Осторожно опустите один миллилитр буфера M9 на агар и закрутите пластину, чтобы выбить L1s, но не эмбрионы.
Центрифугируйте трубку и пипетку L1s непосредственно на бактериальный газон семенной пластины. Держите червей при температуре 25 градусов по Цельсию. Под рассеченным микроскопом при увеличении от 30 до 50 X начните собирать самцов и гермафродиты с синхронизирующих пластин на отдельные несеженные пластины.
Самцы отличаются от гермафродитов выпуклой формой и более светлой окраской мужских хвостов по сравнению с заостренной формой и более темным цветом хвостов гермафродитов. Смойте червей с тарелки одним-двумя миллилитрами буфера M9 с помощью наконечника пипетки, предварительно промытого буфером M9, содержащим 0,01% моющего средства. Переведите червей в одну миллилитровую центрифужную трубку, вращайте в течение одной минуты и добавляйте один миллилитр буфера M9.
Опять же, вращайтесь в течение одной минуты. Добавьте один миллилитр ледяного холодного 70% метанола и хорошо перемешайте. Повторите промывку с одним миллилитрами метанола, хорошо перемешайте.
Раскрутите его в течение одной минуты и добавьте 500 микролитров 70% метанола. Смешайте и храните при четырех градусах Цельсия в течение одного часа до ночи. Пипетка 20 микролитров неподвижных червей на покрытую сторону полиэтиленнафталата или PEN-мембранного стеклянного предметного стекла.
Подождите, пока метанол испарится. Снимите пластиковый щит над сценой и нажмите кнопку разгрузки со стрелкой вверх для загрузки мембранных слайдов. Убедитесь, что слайд полностью высох, переверните так, чтобы мембрана была обращена вниз, и вставьте слайд.
Нажмите кнопку Продолжить в окне изменения образца. Держатель слайда будет двигаться. Затем замените пластиковый щит, в нижней части экрана выберите, какой держатель слайда содержит слайд, и нажмите кнопку выгрузки со стрелкой вниз, чтобы загрузить трубки.
Вытащите лоток и извлеките блок трубки. Вставьте колпачки из четырех 500 микролитровых ПЦР-трубок в держатель и сложите трубку под нее. Верните блок в лоток и сдвиньте лоток обратно в стадию микроскопа.
Во всплывающем окне изменение устройства сбора выберите трубки ПЦР и нажмите кнопку «ОК». Нажмите на пустое место трубки в левом нижнем углу экрана под крышками трубки коллекторного устройства и на панели управления микроскопом выберите TLBF для освещения яркого поля пропускаемого света. Используя объектив 2.5X, отрегулируйте фокус до тех пор, пока не будут видны черви и поверхностная структура PEN-мембраны.
Переключитесь на объектив 20X и переместите сцену в область без червей. Отрегулируйте фокус таким образом, чтобы пузырькообразные структуры в мембране имели желтоватый цвет, чтобы сфокусировать лазер на правильной фокальной плоскости, а затем установить параметры лазера. Для хвостовых кончиков начните с мощности 45 диафрагмы 30 в скорости 20.
На панели управления лазером выберите Калибровка и следуйте инструкциям. Далее в нижней части экрана у коллекторного устройства колпачки трубки нажимают на позицию А, в правой части экрана выбирают одинарную форму, после чего рисуют и вырезают. Затем выделите точку к точке и нарисуйте линию.
Нажмите кнопку пуска так, чтобы лазер прорезал мембрану. Найдите червя и переключитесь, чтобы двигаться и резать. Используйте мышь, чтобы разрезать хвост.
Чтобы собрать образец, переключитесь на настройку рисования и разреза с функцией «точка-точка» и формой рисования, чтобы завершить срез секции мембраны. Выберите следующую трубку у коллекторного устройства крышки трубки в нижней части экрана и вырежьте следующий кончик хвоста. Как только четыре хвоста будут разрезаны, разгрузите стойку трубы, щелкнув выгрузка стрелкой вниз.
Найдите участки мембраны под рассекающим микроскопом и продолжите последующую обработку образцов. Здесь секвенирование РНК с помощью CEL-Seq2. Пипетка 1,2 микролитра мастер-микса грунтовки CEL-Seq2 непосредственно поверх образца и закройте трубку.
Нанесите метку с номером праймера и немедленно поместите крышку трубки непосредственно на кусок сухого льда, чтобы мгновенно заморозить образец, тем самым предотвращая деградацию РНК. Повторяйте до тех пор, пока не будут собраны все образцы. Наконец, храните трубки при минус 70 градусах Цельсия.
C.elegans L3 гермафродиты и самцы через 21-23 часа после вылупления могут быть различимы под рассеченным микроскопом по морфологии их хвостов. Рассказ о гермафродите узок, в то время как рассказ о самцах опух и кажется ясным. На этих изображениях показан внешний вид скользящей структуры PEN-мембраны и хвоста червя.
Здесь фокус правильный для объективов 20X и 40X под микроскопом. Здесь виден рассеченный хвост, беспристрастно вырезанный PEN-мембрана. После закрытия зазора в разрезе, кусок мембраны упадет в крышку трубки под затвором.
Здесь показан колпачок трубки с PEN-мембранным сечением, содержащим рассеченный хвостовой наконечник. Графическое изображение представляет собой уникальный молекулярный идентификатор, преобразованный естественным бревном, или количество UMI на отдельный кончик хвоста для разных временных точек и полов. Программное обеспечение powsimR используется для определения того, сколько независимых образцов требуется для обнаружения дифференциальных экспрессированных или DE генов на различных уровнях экспрессии.
Графическое изображение здесь представляет истинную положительную скорость обнаружения генов DE между двумя условиями для четырех различных симуляций, включающих разные размеры выборки для каждого условия. Пунктирная линия указывает на 80% истинного положительного показателя. Скорость ложного обнаружения и те же четыре симуляции показаны здесь.
Пунктирная линия указывает на 10% ложных обнаружений. Графики показали, что размер выборки в 70 кончиков хвоста на условие достаточен для обнаружения генов DE, за исключением генов с очень низким уровнем экспрессии. Для правильной синхронизации убедитесь, что на пластине присутствуют только эмбрионы.
Чтобы предотвратить потерю пробы, пипетка грунтовки смешивается непосредственно на секцию PEN-мембраны в колпачке и будьте чрезвычайно осторожны при закрытии колпачка. Поскольку он не зависит от видов, мы можем использовать этот протокол для изучения того, как генные регуляторные сети эволюционировали для гомологичных структур у разных видов.
