Общей целью этого протокола является анализ важных ключевых аспектов функции Е3 лигазы, включая специфичность фермента Е2, выбор субстрата и перенос убиквитина. Основным преимуществом данной методики является ее широкая применимость, так как белки из всех эукариотических источников могут быть рекомбинантно экспрессированы и изучены in vitro без необходимости использования специального оборудования. При первом использовании метода разгрузки лизина важно оптимизировать параметры анализа, такие как концентрации ферментов, чтобы определить идеальные условия разряда для выбранной Е3-лигазы.
Чтобы выполнить анализ автоубиквитилирования in vitro, настройте схему пипетирования для проверки функциональной способности различных ферментов E2 и подготовьте мастер-смесь на льду для всех реакций убиквитилирования плюс одна дополнительная реакция. Далее добавляют один микромоляр ферментов Е2 в соответствующие пробирки и инкубируют образцы в термоциклере ПЦР в течение двух часов при указанных условиях. После инкубации добавьте буфер образца SDS к каждой реакции и перемешайте путем пипетирования несколько раз.
Затем немедленно вскипятите образцы при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут и храните денатурированные белки при 20 градусах Цельсия. Чтобы выполнить анализ убиквитилирования субстрата in vitro, подготовьте схему пипетирования для всех реакций. После расчета количества мастер-микса, необходимого для одной реакции, подготовьте мастер-микс для всех реакций на льду и добавьте мастер-микс в каждую трубку.
Добавьте соответствующие лигазы E3 по отдельности. Затем инкубируйте образцы в термоциклере ПЦР в течение двух часов, как показано. В конце инкубации добавьте два раза буфер образцов SDS к каждой реакции, перемешайте несколько раз путем пипетирования и кипятите образцы в течение пяти минут при 95 градусах Цельсия.
Чтобы выполнить анализ разряда лизина, настройте схему пипетирования для реакции зарядки и инкубируйте реакции зарядки в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия. Чтобы остановить реакцию зарядки, добавляют апиразу до конечной концентрации 1,8 единицы на миллилитр и инкубируют реакцию в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце инкубации добавляют ЭДТА к конечной концентрации 30 миллимоляров и используют двойную дистиллированную воду для регулировки объема реакции до 30 микролитров.
Чтобы разрядить убиквитилирование E2 методом E3, установите пять пробирок, соответствующих временным точкам эксперимента, добавьте 6,7 микролитра невосстанавливающегося буфера образца в каждую трубку, удалите шесть микролитров остановленной реакции зарядки из нулевой трубки точки времени и отрегулируйте общий объем до 26,7 микролитров. Чтобы настроить реакции разряда, добавьте к каждой реакции двойную дистиллированную воду, буфер убиквитилирования, BSA, лизин, Е3 лигазу и заряженный Е2. По истечении выбранных периодов времени перенесите 20-микролитровые образцы из каждой реакции разряда в соответствующую пробку.
Затем немедленно вихрьте образцы и поместите их при 70 градусах Цельсия на 10 минут. В этом репрезентативном анализе вестерн-блоттинга неактивный CHIP не был автоматически убиквитилирован. Однако E3-независимые убиквитиновые продукты формировались в присутствии неактивного ЧИПА и при отсутствии ЧИПА.
ЧИП дикого типа был автоубиквитилирован в сочетании с белками семейств UBE2D и UBE2E, тогда как свободные полиубиквитиновые цепи были получены в сотрудничестве с белками семейства UBE2D, но не с белками семейства UBE2E. Связывание убиквитина UBE2N/V1 направляло образование свободных убиквитиновых цепей. Автоубиквитилирование и убиквитилирование UNC-45B наблюдалось с ЧИПом дикого типа, но не с неактивным мутантом ЧИПА, что указывает на то, что UNC-45B действует как консервированная субстрата для ЧИПА.
Когда каталитическая активность CHIP была проанализирована с использованием анализа разряда лизина, незаряженный фермент UBE2D2 имел молекулярную массу 17 килодалтон, а заряженный UBE2D2 с одной молекулой убиквитина имел молекулярную массу примерно 26 килодалтонов. В момент 0 наблюдался весь заряженный выход E2. В присутствии неактивного ЧИПа был обнаружен слабый E3-лигазно-независимый разряд UBE2D2, но не автоубиквитилирование CHIP.
В присутствии чипа дикого типа разряд UBE2D2 был быстрым и завершенным в течение 60 минут, а автоубиквитилирование CHIP указывало на перенос убиквитина на собственные остатки лизина. Из-за ограниченной способности E2 работайте как можно быстрее и немедленно приступайте к реакции разряда с последующим SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. Следуя этим протоколам убиквитилирования in vitro, специфические типы связей убиквитилирования могут быть идентифицированы путем зондирования западных пятен антителами, специфичными для связи.
