Этот протокол облегчает изучение аминопептидасов с различными олигомерными состояниями и олигомеризации зависимых мероприятий, которые сбалансированы между неактивными димерами и активными додекамерами. Этот обычный метод может быть легко выполнен в любой лаборатории. И кроме того, что требуется доступ к лучевой или рентгеновской кристаллографии, не требует специальных приборов.
С некоторой адаптацией, этот метод может быть применен к любому другому белку с активностью или функцией, которая зависит от степени олигомеризации. Для обработки рентгеновских данных пользователи должны иметь минимальное понимание кристаллографии. Мы приглашаем пользователей следить за тренингами, посещать XDS Wiki и смотреть учебники Phenix.
Для проведения анализа деятельности, добавить 25 микролитров 100 мМ L-Лейцин р-нитроанилид до 965 микролитров 50 миллимолярной MOPS, 250 микромолярный кобальт два хлорида и 10% метанола Pre инкубировать смесь реакции в 75 градусов по Цельсию сухой ванне, прежде чем разбавить фермент до одной микромолярной конечной концентрации с дополнительными 50 миллимолярной MOPS. Далее добавьте 10 микролитров одного микромолярского фермента в смесь реакции и вихрем полученного раствора, прежде чем вернуть реакцию на сухую ванну 75 градусов по Цельсию в течение не более одного часа. Когда раствор пожелтеет, остановить реакцию с одним миллилитром 20%кислой кислоты и вихрь смеси, прежде чем позволить ему остыть до комнатной температуры.
Затем перенесите алицит реакционной смеси в клетку спектрофотометра и прочитайте абсорбенты на 410 нанометров против инкубационной смеси реакции без фермента, как отрицательный контроль. Для приготовления апоэнзима добавьте 10 микролитров 1, 10-фенантролового раствора бульона в 890 микролитров 50 миллимолярной MOPS, 0,5 сульфата аммония молара и 100 микролитров очищенного TmPep1050. Проверьте потерю активности с помощью анализа активности, как это было продемонстрировано без добавления кобальта два хлорида.
После анализа перенесите образец в диализную трубку и облизбейте образец против 200 миллилитров 50 миллимолярной MOPS и 0,5 мларного сульфата аммония при четырех градусах Цельсия. Обмен диализа со свежим буфером три раза в течение 48-часового диализа и собирать образец из трубки диализа. Используя ультрафильтрационные установки с 30 килодальтонным вырезом, концентрируйте образец обратно до 100 микролитров и проверяйте концентрацию на нанообумном спектрофотометре на 280 нанометров.
Для приготовления димеры разбавляют апоэнзим до одной микромолянной концентрации в 50 миллимолярных MOPS и 0,5 моларного сульфата аммония, и инкубируют реакцию в течение двух часов в сухой ванне 75 градусов по Цельсию. Затем сконцентрировать образец фермента, когда по крайней мере 50 микролитера концентрации и проверить молекулярный вес по размеру исключение хроматографии. Чтобы улучшить форму, размер и кристалличность кристаллов белка, добавьте соответствующий объем оптимизированного раствора кристаллизации в каплю кристаллов, чтобы довести объем кристаллической капли до 10 микролитров.
Перенесите капельку в микротрубку 1,5 миллилитров и добавьте еще 90 микролитров раствора кристаллизации в семенной колодец. Для каждого разбавления семян добавьте 500 микролитров кристаллизации реагента на скважину к соответствующему количеству скважин в кристаллизации пластины и смешайте два микролитров образца белка с двумя микролитров кристаллизации реагента и 0,2 микролитров семян в одну поддержку кристаллизации на скважину. Затем зафиксните опоры на каждом колодец кристаллизации реагента.
Для сбора кристаллов, заполнить ванну с жидким азотом и окунуть любые флаконы или корзину, используемую для обработки образца в азот. Обработка жидкого азота является опасным это может вызвать сильные обморожения. Обязательно носите надлежащие индивидуальные защиты, такие как криогенные перчатки и защитные очки для глаз.
Наберите петли выбора образцов различных размеров в зависимости от размера кристалла и используйте бинокль, чтобы выбрать каплю, содержащую кристаллы. Затем используйте петлю, чтобы аккуратно выбрать изолированный кристалл из одного хорошо и сразу же окунуть петлю в жидкий азот, прежде чем поместить петлю в подходящий флакон. Для измерения интенсивности дифракции, создайте папку, из которой будет запущен XDS, и найдите путь к изображениям.
Для запуска xdsme введите команду в окне терминала. После завершения XDS задания проверьте правильный файл lp и обратите внимание на вероятность определения космической группы, полноту данных, наивысшее разрешение, кристаллическую мозаику и качество данных. После проверки бессмысленного журнала XDS для получения вероятности космических групп используйте команды для повторного запуска xdsme с помощью различных решений космической группы, предложенных XDS, в отдельной папке, чтобы избежать переопределения предыдущего процесса.
После выбора наилучшего решения, основанного на статистике данных, введите команды для запуска XSCALE и XDSCONV. Чтобы определить фазу без аномального рассеяния, используйте координаты 4P X, Y, чтобы подготовить стартовую модель для молекулярной замены. Из файла PDB используйте редактор файлов Phenix PDB для извлечения мономера и усечения аминокислот в аланине.
Вы запустите X, оформив XDSCONV и последовательность в качестве входных данных. Проверьте файл журнала из Xtriage. Обратите внимание на полноту, количество подразделений в асимметричном блоке, анисотропию, наличие ледяных колец и побратимство.
Для запуска Phaser-MR в Phenix для молекулярной замены выберите файл отражения, последовательность и стартовую модель 4P six Y, усеченную в полиаланине, и нажмите Run. По завершении, проверьте, если модель была найдена и проверить счет молекулярной замены. Коэффициент перевода, по крайней мере восемь баллов, указывает на то, что решение является окончательно правильным.
После определения фазы молекулярной заменой выберите Run Auto Build и нажмите Run. Все необходимые файлы будут добавлены автоматически. По завершении проверки модели в COOT и сборки и уточнения модели вручную, в соответствии с картой плотности электронов в COOT.
Используя эту модель, последовательность и данные дифракции в качестве входных данных, уточните вручную кураторую модель в Phenix, ссылаясь на Phenix, чтобы помочь выбрать правильную стратегию. После уточнения проверить результаты, уточнение бесплатно и уточнения работы должны уменьшиться. Показатели MolProbity должны соблюдаться, а выбросы с низкой реальной корреляцией пространства должны быть ограничены.
Когда будет создана лучшая усовершенствованная модель, запустите MolProbity на сервере и проверьте любые выбросы, идентифицированные программой. Хроматография исключения размера может быть использована для определения очевидного молекулярного веса очищенного белка. Состояние кристаллизации пептида, может быть оптимизирован путем изменения рН по сравнению с концентрацией ПЭГ вокруг состояния димера.
Например, лучшие кристаллы TmPep1050 H60A H307A были получены в 0,1 молярного цитрата натрия с рН 5,2 и 20%PEG 3350 концентрации, после одного цикла микро посева для улучшения микрокристаллизации. В этом анализе индексация данных показала, что космическая группа Кристалла TmPep1050 H60A H307A была C2221, но XDS предложила другое решение, космическую группу MP. Структура TmPep1050 H60A H307A, может быть завершена после нескольких циклов автоматизированного и ручного уточнения.
Подтверждение олигомерного состояния с поверхностью интерфейса 1 710 квадратных ангстремов между мономерами и свободной энергией формирования интерфейса минус 16,2 килокалорий на родинку. Здесь можно наблюдать крупным планом активного сайта TmPep1050 H60A H307A по сравнению с активным сайтом димера TmPep1050 и додекамера. При построении модели позаботьтесь о том, чтобы построить только то, что вы видите в плотности электронов, чтобы избежать чрезмерной интерпретации, данных и не времени отполировать модель.
Молекулярный вес димера и додекамера также может определяться родной масс-спектрометрией. А методы могут быть полезны для обнаружения переходных олигомеров.
