Этот протокол содержит подробные наброски того, как совместно культуры зубной пульпы стволовых клеток с тригеминальных нейронов. С его помощью мы можем исследовать несколько ответов, движимых их перекрестным разговором. Основным преимуществом этого метода является способность изучать и манипулировать любой или обеих популяций клеток и точно измерить результаты.
Этот метод имеет непосредственное отношение к нейронным исследованиям и может дать представление о том, как стволовые клетки зубной пульпы восстанавливают нервную ткань, поврежденную травматическими событиями или нейродегенеративными заболеваниями. Там в нескольких стадиях этой техники, чтобы узнать, и это может быть трудно сохранить тракта из них всех. В этом протоколе подробно каждый этап, чтобы помочь с этим.
Зубной пульпы и ганглиев трудно разогнать и требуют различных вихрей и трубопроводов. Даже тогда вы не получите полную дисперсию, поэтому потребуется оптимизация и репликации. После усыпаемости мыши, поместите голову на одноразовый underpad так, что рот к потолку и основание шеи плоская на рабочей поверхности.
Используйте лезвие бритвы и распилив движение, чтобы отделить челюсти от челюсти. Удалите язык ножницами или типсами, чтобы облегчить доступ к молярам. Поместите открытую голову в блюдо на стерильную марлевую площадку и поместите образец под рассеченный микроскоп.
Удалите альвеолярную костную ткань, окружающую первые моляры. Вставьте миппы в альвеолярное отверстие и дразнить ткани от зуба к buccle или лингвальной стороне рта. Соберите все челюстно-первые моляры и аккуратно перенесите подчелюстные и челюстно-максилярные первые моляры в отдельное блюдо клеточной культуры с 1X PBS на льду.
Удалите эмаль внешнего органа, окружающего снаружи каждого челюстного первого молара. С набором типсов поверните моляр так, чтобы пороги вниз и открытый корень подвергается. На дне зуба есть овальное отверстие и непрозрачная ткань зубной пульпы, инкапсулированная тонким слоем дентина и эмали.
Используя кончик типсов, аккуратно ослабьте зубную пульпу, запуская одну руку типсов вокруг внутренней окружности минерализованной ткани. Удалите ткани зубной пульпы из минерализованной структуры и перенесите на третье блюдо, содержащее 1X PBS. Удалите эмаль внешнего органа, если он еще не отделен.
Перенесите всю ткань зубной пульпы на 0,25%трипсина EDTA в 50 миллилитровую коническую трубку. Vortex смесь и поместите его в 37 градусов по Цельсию теплой водяной бане в течение 10 минут. Под стерильным капюшоном, добавить нагревается со-культуры средств массовой информации в окончательное соотношение по крайней мере один-к-одному средств массовой информации, чтобы trypsin инактивировать фермент.
Pipet средств массовой информации вверх и вниз несколько раз с 10 миллилитров пипетки для дальнейшего разгона зубной пульпы в средствах массовой информации, избежать больших пузырьков. Перенесите один миллилитр рассеянной зубной пульпы в каждую колодец из 24-хорошо ткани культуры пластины. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию.
И позволяют клеткам прикрепляться и мигрировать из недисперсной ткани в течение 48 часов, прежде чем менять средства массовой информации. После усыпления и удаления кожи вставьте кончик пары микро рассечения ножниц в основание черепа. Вырезать вдоль sagittal шва черепа.
Сделайте четыре небольших горизонтальных разреза вдоль корональных швов ушами до тех пор, пока вдоль лямбдоида швы основания черепа. Это создает два лоскута кости. Используйте типсы, чтобы очистить два лоскута кости, чтобы выявить мозг.
Найдите тригеминальные ганглии, расположенные в матере дуры между мозгом и костью челюстно-челюстного процесса. Отрежьте три ветви, которые путешествуют к глазам, челюсти, и челюсти. И использовать прямой край тонкой типсов для передачи ганглиев холодной 1X PBS в блюдо на льду.
После того, как все тригеминальные пучки собирают использовать файл тибры для передачи ганглиев до 50 миллилитров конической трубки, содержащей пять миллиграммов на миллилитр стерильной фильтрованной коллагеназы типа II.Vortex смеси и место трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25 до 30 минут. Каждые пять-десять минут, возьмите трубку из водяной ванны, вихрь, и вернуться в ванну. Центрифуга коллагеназы тригеминального нейрона раствор в течение двух минут при 643xg.
Под капюшоном культуры ткани, нежно аспирировать коллагеназу с micropipet и добавить пять миллилитров 1%стерильный фильтрованный трипсин типа II.Then поместите трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 25 до 30 минут и в течение этого периода времени вихрь трубки кратко каждые пять минут. Добавьте средства массовой информации при соотношении трипсина один к одному в средствах массовой информации, чтобы отключить оставшийся трипсин. Подсчитайте количество клеток и разбавьте смесь до 200 000 клеток на миллилитр в средствах массовой информации.
Поместите фильтры с покрытием трансвелла в скважины с зубной пульпой. Трубы 250 микролитров на трансуэлл фильтр и культуры клеток на 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день, заменить средства массовой информации с одним миллилитр со-культуры средств массовой информации дополняется одним микромолярной уридина и 15 микромоляных 5-Fluoro-2'deoxyuridine, чтобы остановить чрезмерное распространение мезенхимальных клеток, которые могут предотвратить нейрит рост.
Вы должны добавить митотические ингибиторы на второй день или нейрит роста не произойдет. В этом исследовании, тригеминальный нейрит рост был увеличен в присутствии первичных клеток зубной целлюлозы в основной хорошо по сравнению с контролем тригеминального нейрита монокультуры. Первичные клетки, изолированные от рецептора TGF-бета 2 flox/flox mouse, были эквивалентны по количеству после инъекций либо ade-Cre-GFP, либо ade-eGFP.
Полуколичебный ПЦР демонстрирует, что аденовирус-Cre-GFP удалил фланговый ген, трансформифицивющий бета-рецептор фактора роста 2 с аденовирусом-eGFP, выступающей в качестве контрольного вирусного вектора. В культурах с преобразованием фактора роста бета-рецептора 2 удаление нейрита было уменьшено. Яркие полевые изображения трансвелловых фильтров после кристально фиолетового окрашивания популяций клеток показывают, что преобладают большие поры.
Большая стрелка указывает на клетку с мезенхимальной морфологией, в то время как маленькая стрелка указывает на клетку нейрональной морфологии. Кристаллический фиолетовый окрашенных обеих клеток без предвзятости. Кроме того, иммунофторесценция окрашивания бета-III тубулина с alexa 488 вторичных антител показывает неспецифическое окрашивание нескольких клеток делает визуализацию афферентных структур трудно.
Поскольку ни клетки зубной пульпы, ни тригеминальные нейроны легко рассеиваются, каждому исследователю необходимо будет оптимизировать свои процедуры покрытия. Если вы культуры стоматологической целлюлозы клетки только в отдельных скважинах вы можете использовать иммунофлюоресценции или вы можете количественно РНК или белковых уровней, чтобы определить, как зубные клетки целлюлозы реагируют на нейроны. Не забудьте отбелить любые контейнеры или советы, которые вступают в контакт с аденовирусом.
Будьте уверены, чтобы отказаться от бритв правильно в острый бен.
