Этот протокол позволяет фибробластам создавать и организовывать свою собственную среду в определенных механических условиях. Это приводит к образованию анизотропных тканей с жесткостью и матричными композициями, сопоставимыми с естественной средой клетки. Этот метод позволяет сравнивать до 48 условий параллельно.
Он является гибким по отношению к используемому типу клеток и условиям культивирования. Используя только несколько четко определенных компонентов, он воспроизводится между лабораториями. Применяя профиброзные факторы или антифиброзные препараты, этот протокол может быть использован для изучения основных процессов и методов лечения фиброзных заболеваний любого рода.
Демонстрировать процедуру будут Алиса Дегрейв, аспирант из нашей лаборатории, и я. Для начала разморозьте крио-сохраненные сердечные фибробласты на водяной бане при 37 градусах Цельсия в течение примерно двух минут, пока во флаконе не останется только небольшое количество льда. Затем перенесите клеточную суспензию по каплям с помощью серологической пипетки с двумя миллилитрами в соответствующую стерильную центрифужную трубку, содержащую 10 миллилитров питательной среды фибробластов.
Для оптимального извлечения клеток промыть криокомандр одним миллилитом калечащих операций на женских половых органах и перенести его в трубку центрифуги. Аккуратно повторно суспендировать клетки и перенести в колбу клеточной культуры. Восполняйте калечащие операции на женских половых органах через день в течение пяти дней или до тех пор, пока клетки не достигнут 80%-ной концентрации.
После аспирации среды из культивируемых клеток промыть клетки шестью миллилитрами PBS и аспирата, затем добавить шесть миллилитров реагента диссоциации клеток к клеткам и инкубировать до тех пор, пока не будет видна отслойка клеток. Нейтрализуют ферментативную активность, добавляя от шести до 12 миллилитров КОЖПО к вытесненным клеткам в клеточном ассоциативном реагенте. Аккуратно пипетку вверх и вниз четыре-восемь раз, используя 10-миллилитровую серологическую пипетку, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию и перенести клетки в свежую 50-миллилитровую сборную трубку.
Проверьте выход с помощью автоматизированного счетчика ячеек в соответствии с инструкциями производителя и гранулируйте ячейки. После центрифугирования аспирируйте супернатант, щелкните трубкой, чтобы выбить гранулу и повторно суспендировать клетки при калечащих операциях на женских половых органах. Затем процедите клеточную суспензию через 40-микрометровый сетчатый клеточный сетчатый фильтр, затем, используя автоматизированный счетчик клеток, оцените количество клеток и жизнеспособность путем исключения электрического тока, чтобы обеспечить надежные номера клеток, прежде чем приступать к инженерным соединительным тканям или препарату ЭСТ.
Чтобы подготовиться к ЭСТ, отрегулируйте клеточную суспензию до 8,9 миллиона клеток на миллилитр при 20-25 градусах Цельсия, добавив FGM и удерживайте клетки на льду. Переложите все остальные трубки, содержащие отдельные компоненты гидрогелевой смеси ЭСТ, на лед и предварительно охладите пустую 50-миллилитровую центрифужную трубку для приготовления смеси. Начинают приготовление гидрогелевой смеси ЭСТ с добавления компонентов, описанных в тексте, в предварительно охлажденную 50-миллилитровую центрифужную трубку, предотвращая образование пузырьков воздуха.
Во-первых, пипетка кислоторастворимого коллагена типа I гидрогеля в серологическую пипетку с широким наконечником отверстия. Отрегулируйте содержание соли в растворе коллагена, добавив DMEM, осторожно закручивая трубку для правильного смешивания. Чтобы нейтрализовать рН, добавляют 0,2 молярного гидроксида натрия во время закручивания трубки и подтверждают нейтрализацию, наблюдая за красным цветом индикатора фенол-красного цвета.
Затем добавьте клеточную суспензию по каплям, осторожно закручивая трубку. Перемешайте суспензию, осторожно прокладывая трубы вверх и вниз только один раз, используя серологическую пипетку с широким наконечником отверстия, чтобы избежать образования пузырьков и свести к минимуму напряжение сдвига. Аккуратно закрутите трубку 10 раз для тщательного перемешивания.
Держите центрифужную трубку, содержащую смесь гидрогеля ЭСТ, на льду на протяжении всего процесса литья. Смочите наконечник пипетки в один миллилитр в гидрогелевой смеси ЭСТ, затем равномерно распределите 180 микролитров гидрогелевой смеси в каждую форму 48-луночной литейной пластины, избегая чрезмерных сил сдвига, которые могут повлиять на целостность сборки коллагеновой матрицы и гарантируя, что вся пластина закончится за 15-20 минут. Убедитесь, что в пресс-форме образуется полная петля, поскольку прерывистое распределение смеси ЭСТ предотвратит полное образование кольца ЭСТ.
Избегайте пипетки во внутреннюю скважину и образования пузырьков во время пипетки, чтобы обеспечить равномерное литье гидрогеля ЭСТ для формирования однородной и функциональной ткани. Осторожно поместите 48-луночную литейную пластину внутрь инкубатора клеточных культур, чтобы восстановить гидрогелевую смесь ЭСТ в течение 15-30 минут. После инкубации он выглядит гелеобразным и непрозрачным.
Аккуратно добавьте 600 микролитров теплого КЖПО 37 градусов по Цельсию на скважину вдоль стены, чтобы избежать отслоения ЭСТ от дна. Заменяйте среду каждый день 500 микролитрами калечащих операций на женских половых органах до анализа. В нужных временных точках используйте стереомикроскоп для записи микроскопических изображений верхнего и бокового видов ЭСТ.
Используйте программу обработки изображений для выполнения анализа сканирования строки. Установите шкалу и используйте инструмент «Прямая линия» для отслеживания и измерения диаметров ЭСТ не менее чем в шести положениях на руку в каждой плоскости изображения. Представьте себе 48-луночную литейную пластину под записывающим устройством со встроенной камерой сканирования площади, размещенной на фиксированном расстоянии, оснащенной монохромным датчиком изображения высокого разрешения и источником света, близким к ультрафиолетовому излучению.
Выполните автоматическое обнаружение наконечников полюсов, содержащих флуоресцентный краситель для максимизации контрастности. Измерьте расстояние между полюсами из ежедневных записей с помощью автоматизированного анализа, запустив записанные изображения на программном обеспечении для обнаружения высококонтрастных ярких пикселей на темном фоне или программе обработки изображений. Снимите ЭСТ с опорных столбов и вставьте передающий крюк и петлю ЭСТ.
Затем перенесите ЭСТ на два крючка, зажатых к неподвижному рычагу, и рычаг преобразователя удлинительного динамического механического риометра, оснащенного закаленной органной ванной с температурой 37 градусов Цельсия, заполненной PBS. Применяйте одноосное натяжение с постоянной линейной скоростью, установив риометр примерно на 1% от начального расстояния между крючками в секунду. Постоянная скорость растяжения 0,03 миллиметра в секунду может быть использована с типичными размерами ЭСТ.
Разорвите усилие преобразователя и инициируйте растяжение. Ведите запись до точки разрыва ЭСТ после нормализации измеряемой силы по площади поперечного сечения и построения кривой напряжения-деформации, определяющей различные биомеханические параметры. Непосредственно перед тем, как ткань начинает микроразрыв пласта, верхняя граница эластичной области соответствует температуре текучести, а ее деформация является мерой эластичности ткани.
Пластиковая область находится между температурой текучести и точкой отказа. Точка отказа соответствует внезапному падению напряжения из-за разрыва ткани, определяя конечную деформацию, которая является мерой растяжимости ткани. Третья точка измерения соответствует максимальной прочности, определяемой самым высоким напряжением, которое ткань может выдержать, не ломаясь во время растяжения.
Упругость и ударная вязкость, задаваемые областью под кривой, соответствуют энергии, поглощаемой тканью, вплоть до температуры текучести и точки отказа соответственно. Для каждой полученной кривой наклон линейной части упругой области соответствует модулю Юнга, также известному как модуль упругости. Это механическое свойство, которое измеряет жесткость ткани.
Используя этот протокол, уплотнение и сжатие ЭСТ в контрольных условиях и в присутствии FCS последовали через несколько часов после заброса и заметно увеличились до пятого дня. Когда ЭСТ обрабатывали ингибитором полимеризации актина Латрункулином А, уплотнение ЭСТ уменьшали, о чем свидетельствует значительно более высокая площадь поперечного сечения по сравнению с контролем. Сокращение тканей оценивали в течение пяти дней посева.
При отсутствии латрункулина А сокращение постепенно увеличивалось до пятого дня, достигая около 40% сокращения. Тем не менее, присутствие латрункулина А повлияло на сокращение ткани, что привело только к 20% максимальному сокращению. Ингибирование полимеризации актина привело к значительному снижению примерно на 50% жесткости тканей по сравнению с контролем.
Эти результаты показывают, что целостность актина цитоскелета необходима для уплотнения, сокращения и жесткости ЭСТ. Важно выбрать надежный, высококачественный коллагеновый раствор и убедиться, что одноклеточная суспензия с высокой жизнеспособностью используется для восстановления инженерных соединительных тканей.
