Белок производства синтетических клеток предлагают универсальную платформу для изучения истоков жизни, а также синтетических клеток на основе терапии для передовых доставки наркотиков. Этот метод прост и доступен для экспрессии РНК и белка и может быть применен для производства терапевтического белка на месте непосредственно внутри организма. Системы могут быть использованы для лечения широкого спектра заболеваний от метаболических заболеваний и белковых заменителей до рака и, возможно, диабета.
Этот многоступенчатый протокол имеет определенную точку остановки. При его выполнении впервые рекомендуется разделить работу на несколько дней. Протокол производства синтетических клеток начинается с подготовки безклеточного лисата S30-T7.
Далее мембранные липиды и клеточный питательный раствор готовы имитировать внутреннюю среду и поддерживать выработку белка. Заключительным шагом является подготовка самих синтетических клеток. Подготовка дубликатов стартовых культур в 100 миллилитров фляг Erlenmeyer.
К каждой колбе добавьте пять миллилитров ЛБ-медиа, дополненных 50 микрограммами на миллилитр ампициллина и прививки с одной колонией E.coli. Выращиваем культуру на ночь в шейкере инкубатора пола при 250 об/мин и 37 градусах по Цельсию. Затем приготовьте два литра сбитых с толку колб Erlenmeyer, содержащих 500 миллилитров противотуберкулезных средств, дополненных 50 микрограммами на миллилитр ампициллина.
Прививать каждую двухлитровую колбу с пятими миллилитровой стартовой культурой. Поместите колбы в шейкер при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию. Мониторинг культур периодически с помощью спектрофотометра и расти культур до OD600 между 0,8 и один.
Чтобы вызвать экспрессию РНК-полимеразы T7, добавьте к каждой колбе три миллилитров 100 миллимолярный IPTG, чтобы достичь 0,6 миллимоляра. Продолжайте выращивать культуру до тех пор, пока OD600 не составит примерно четыре. После того, как культуры достигнут желаемой оптической плотности, перенесите суспензию с каждой колбы Erlenmeyer в две стерилизованные центрифуги на 250 миллилитров.
Центрифуга труб при 7000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта. Resuspend каждую гранулу в 250 миллилитров холодного S30 лисат буфера с помощью мешалки при желании.
Центрифуга при 7000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно смешайте все гранулы вместе в 15 миллилитров холодного буфера лисата S30. Фильтр подвески с помощью марлевых колодок.
Прежде чем приступить к следующему шагу, предварительно позолоть советы в 1,5 миллилитров флаконы, которые будут необходимы для хранения лизата. Гомогенизировать подвеску дважды. Используйте рабочее давление 15 000 PSI с давлением воздуха в четыре бара для поломки клеток.
Соберите гомогенат. Добавьте 100 микролитров 0,1 молярного DTT на 10 миллилитров однородной подвески. Центрифуга подвески при 24 700 раз g при 30 минутах при четырех градусах Цельсия.
DTT и хлороформ классифицируются как раздражающие и вредные и поэтому следует относиться с осторожностью. Хлороформ, используемый позже в протоколе, должен использоваться в области с извлечением дыма. Чтобы сохранить лисовую активность, выполните шаг быстро.
Поместите 200 микролитровых алицитов супернатанта в предварительно охлажденные флаконы и немедленно захватьте их жидким азотом. Храните флаконы при отрицательном 80 градусов по Цельсию для использования в будущем. Отдельно растворяют POPC и холестерин в хлороформе каждый до конечной концентрации 100 миллиграммов на миллилитр.
Вихрь каждого флакона отдельно. Смешайте компоненты в двухми миллилитровом стеклянном флаконе. Добавьте 50 микролитров холестериново-хлороформного раствора, 50 микролитров раствора POPC-хлороформа и 500 микролитров минерального масла.
Vortex флакон, а затем испаряться хлороформ, нагревать его в течение одного часа при температуре 80 градусов по Цельсию в химическом капюшоне. Перед началом стадии производства синтетических клеток подготовьте внешние, предвторние и кормовые растворы, описанные в рукописи. Затем поместите 1,2 миллилитров внешнего раствора в 15 миллилитровую трубку и медленно добавьте слой из 500 микролитров липидного раствора из первого стеклянного флакона.
Инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 20 минут. Чтобы завершить подготовку внутреннего раствора, смешайте на льду до конечного объема 100 микролитров, добавив лизат S30-T7 и плазмиду ДНК. Добавьте 100 микролитров внутреннего раствора с лизатом и плазмидой во второй двухми миллилитровый стеклянный флакон с 500 микролитров липидно-масляного раствора.
Pipette вверх и вниз энергично в течение одной минуты, а затем вихрь еще минуту на уровне пять. После инкубации результирующей эмульсии в течение 10 минут на дробленом льду, медленно добавить эмульсии на верхней части фазы масла в 15 миллилитров трубки. Центрифуга трубки в течение 10 минут при 100 раз г и четыре градуса по Цельсию.
Затем центрифуга в течение 10 минут при 400 раз г и четыре градуса по Цельсию. К концу центрифугации гранулы должны наблюдаться в нижней части трубки. Чтобы извлечь гранулы, сначала удалите избыток слоя масла.
Далее загрузите обрезанный наконечник пипетки примерно с 400 микролитров внешнего раствора и используйте наконечник пипетки для сбора гранул, выпуская внешний раствор по мере того, как наконечник пипетки проходит через нефтяную фазу. Протрите наконечник пипетки и перенесите гранулы в чистую 1,5 миллилитровую трубку. Центрифуга гранулы в течение 10 минут при 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию.
Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 100 микролитров кормового раствора. Для экспрессии белка, инкубировать подвеску в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию без встряхивания. Плазмиды, выражаюющие модель белка sfGFP и Renilla luciferase, были введены в синтез белка без клеток, оптовые реакции CFPS и синтетические клетки.
Производство белка оценивалось несколькими методами. Западный анализ помарки обнаружил производство sfGFP His6 как в массовых реакциях CFPS, так и внутри синтетических клеток. Очищенный sfGFP His6 был использован в качестве положительного контроля.
Флуоресцентный микроскоп с Брайтфилдом и фильтром GFP показывают синтетические клетки, которые производят sfGFP. Цитометрия потока была использована для анализа sfGFP производства синтетических клеток. Расчет активной популяции синтетических клеток был основан на пороге интенсивности флуоресценции SFGFP, определяемом отрицательным образцом ДНК, представленным красной гистограммой.
Средняя интенсивность флуоресценции SFGFP производства синтетических клеток была рассчитана из активной популяции синтетических клеток и нормализована до отрицательного образца ДНК. Распределение диаметра активных синтетических клеток рассчитывался на основе сигнала SFGFP. Активность Рениллы люциферазы была количественно оценена с помощью измерений люминесценции.
Этот метод является весьма универсальным и может быть оптимизирован для различных целевых белков путем изменения лизировать происхождения, липидного состава и внутренних концентраций раствора. FACS анализ синтетических клеток, производящих флуоресцентный маркер белка может быть выполнена для обеспечения количественной ценности доли активных синтетических клеток. Западный анализ помарки измерит продукцию протеина.
