Этот протокол упрощает и уточняет методы реализации синтеза самобелк неэкспертами. Улучшение доступа к этим методам поможет демаркетизировать платформу и широкий набор приложений, которые она позволяет. Основными преимуществами этой техники являются скорость, рентабельность и простота реакции, настроенная по сравнению с другими платформами синтеза повторного белка.
Наша платформа может включить ряд приложений, включая функциональную геномику, hythopertesting, биосенсоры, образовательные наборы, и с незначительными изменениями, метаболической инженерии и расширения генетического кода. Хотя этот метод требует только базовой лабораторной подготовки, новые пользователи должны планировать, чтобы ознакомиться с методами, как sonication для успешного выполнения протокола. Для начала этой процедуры подготовить все средства массовой информации и культуры E.coli клетки, как указано в текстовом протоколе.
Поместите одну литровую бутылку центрифуги в ванну с ледяной водой. После того, как культуры OD600 достигает 3,0, залить клеточной культуры в охлажденной бутылке. Используя двойной баланс пучка, добавьте воду во вторую бутылку центрифуги на один литр, пока она не весит так же, как первая, чтобы создать баланс для центрифуги.
После предварительного охлаждения центрифуги до четырех градусов по Цельсию, центрифуга бутылки на 5000 г и при 10 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать клетки. После этого, медленно слить и избавиться от супернатанта. Поместите гранулы клетки на лед.
С помощью стерильного шпателя выскаблить гранулы клетки из бутылки центрифуги и передать его в холодную, 50 миллилитров конической трубки. Добавьте 30 миллилитров холодного буфера S30, дополненных двумя миллимолярной DTT и повторно посовестите гранулы вихрем короткими очередями с периодами отдыха на льду до тех пор, пока гранулы полностью не будут перерасходоваться без кусков. После этого используйте еще 50-миллиметровую коническую трубку, наполненную водой, в качестве баланса для центрифуги образца при 5 000 г и 10 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Слейте и избавиться от супернатанта. Переусердуйте гранулы с 20 до 25 миллилитров холодного буфера S30. Центрифуга при 5 000 г и при 10 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Вылейте и избавиться от супернатанта. Затем добавьте 30 миллилитров буфера S30 и повторно посовелите гранулы с помощью вихря, как описано ранее. Установите три предварительно взвешенных, холодных, 50 миллилитров конических труб.
Используя серологический наполнитель пипетки со стерильной пипеткой, aliquot десять 10 миллилитров гранул подвески в каждой трубке. Центрифуга всех труб, используя соответствующие балансы по мере необходимости на 5000 г и 10 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После этого вылить и избавиться от супернатантов.
Тщательно протрите внутри каждой трубки и крышка с чистой тканью, чтобы удалить буфер доступа, убедившись, что избежать прикосновения гранулы. Используя аналитический баланс, переутомлите трубки и сообщите об окончательном весе гранул для каждой трубки. Для начала добавьте один миллилитр холодного буфера S30 с 2 миллимолярными DTT на один грамм клеточной массы к каждой грануле.
Используйте вихрь для повторного перерасхода гранул, как описано ранее. Затем перенесите 1,4 миллилитров каждой повторной гранулы в отдельные 1,5 миллилитровые трубки Microcentrifuge. Поместите одну трубку в ледяную водяную ванну в стакан и распоисните зонд sonicator таким образом, чтобы он не касался дна или сторон трубки.
Sonicate трубки с амплитудой установлен на 50% в течение 45 секунд, а затем 59 секунд отдыха. Убедившись, чтобы закрыть и инвертировать трубы во время от периодов. Сразу же после того, как sonication завершена, добавить 4,5 микролитров одного молара DTT в лизат.
Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать, а затем поместить его на лед. Повторите этот процесс, sonicating и добавление DTT для каждой трубки повторного перерасхода клеток. Центрифуга образцов при 18 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.
После этого, пипетка каждый супернатант в новый 1,5 миллилитр Microcentrifuge трубки, оставляя некоторые supernatant позади, чтобы обеспечить гранулы не нарушается. Возьмите трубки супернатанта на дрожание платформы инкубатора и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 250 об/мин в течение 60 минут. Это реакция на второй этап.
Затем центрифугировать образцы на 10 000 г и при четырех градусах По Цельсию в течение 10 минут. Удалите каждый супернатант, не нарушая гранулы передачи их в новые трубы. Создайте много 100 микролитров алицитов экстракта для хранения.
Во-первых, раствор оттепели A, раствор B, шаблон ДНК, экстракт BL21DE3, T7 РНК-полимераза и алицит молекулярной воды на льду. Затем наклеить необходимое количество микроцентрифугных трубок, необходимых для реакции CFPS. Смешайте каждый реагент путем трубопроводов или вихрей, затем добавьте раствор в помеченную реакционной трубку, убедившись, что не вихрь экстракт клетки, но вместо инвертировать трубку, чтобы смешать.
Убедитесь, что окончательная реакция хорошо смешана и объединить в один 15 микролитер шарик в нижней части каждой трубки. Инкубировать каждую реакцию, не встряхивая при 37 градусах по Цельсию в течение четырех часов, или при 30 градусах по Цельсию в одночасье. Для начала, получить 96 пластины и загрузить 48 микролитров 0,05 молар HEPES при рН 8 в каждый колодец, необходимый для количественной оценки.
Затем удалите реакционной трубки из инкубатора. Смешайте каждую реакцию, трубя вверх и вниз, и перенесите два микролитров каждой реакции в скважины, содержащие HEPES. Смешайте каждый колодец, трубя вверх и вниз.
После того, как все реакции загружаются и смешиваются, загрузите пластину в флуорометр и измерьте флуоресцентные лампы конечной точки SFGFP, используя волну возбуждения длиной 485 нанометров и длиной волны выбросов 510 нанометров. Используйте ранее сгенерированную стандартную кривую для определения концентрации сверхкратного GFP от полученных люминесцентных показаний. В этом исследовании, sonication основе E.coli экстракт подготовки расследуется.
Клеточные гранулы и клеточный экстракт стабильны при отрицательных 80 градусах по Цельсию, по крайней мере, год. Кроме того, экстракт клетки может пройти по крайней мере пять циклов замораживания оттепели без значительной потери производительности. Некоторые шаги в рамках этого протокола могут быть разнообразны без ущерба для общей производительности системы.
В частности, клетки могут быть собраны в диапазоне от 2,7 до 4,0 оптической плотности на 600 нанометров без существенного влияния на продуктивность экстракта клеток. Тем не менее, качество ДНК шаблона является источником вариативности от партии к партии, что влияет на объемные урожаи реакции CFPS. Это решается путем очистки ДНК с помощью Midi или Maxiprep следуют дополнительные МЕРЫ по очистке ДНК.
Реакционной сосуд также влияет на объемные урожаи реакции CFPS. Увеличение площади поверхности к соотношению объема, приводит к более высокой объемной урожайности. Для оптимизации объемных урожаев реакции CFPS и снижения вариативности партии экстракта клетки к партии для каждого нового препарата экстракта необходимо выполнять титрование магния.
Для клеточных экстрактов, состоящих из 30 миллиграммов на миллилитр общего белка, оптимальная концентрация магния и объем экстракта для минимизации использования реагентов и максимизации объемной урожайности составляет 10 миллимолейных и пять микролитров соответственно. Изменяя шкалу реакции, пользователи могут использовать методы, начиная от высокой пропускной способности скрининга в более широком масштабе выражения целевого белка. Этот метод обеспечивает два ключевых преимущества, во-первых, он проверяет белковые продукты быстрее, а во-вторых, он синтезирует трудно выразить белков.
Примеры включают белки, которые являются цитотоксическими или требуют окисления условий для их функции. Как и в любой лабораторной процедуре, ко всем реагентам следует относиться с осторожностью. Кроме того, центрифуги всегда должны быть сбалансированы и защита уха должны быть использованы во время sonication.
