Бесклеточный метод аутоиндукции уменьшает надзор исследователя и время, необходимое для производства функциональных клеточных экстрактов. Это упрощает предыдущие протоколы синтеза белка in vitro, которые были более трудоемкими и интенсивными. Эта техника менее сложна, а также высокопродуктивна, что позволит большей аудитории реализовать бесклеточную экспрессию.
Этот метод подчеркивает важность энергетического метаболизма во время роста клеток и в бесклеточных реакциях. Начните с приготовления 960 миллилитров бесклеточных автоиндукционных сред. Затем стерилизуйте среду в 2,5-литровой сбитой с толку колбе путем автоклавирования в течение 30 минут при 121 градусе Цельсия.
Далее, после приготовления 40 миллилитров сахарного раствора, фильтруют-стерилизуют его в отдельную автоклавную стеклянную емкость. После автоклавирования, когда культуральная среда остынет до температуры ниже 40 градусов Цельсия, добавьте стерилизованный фильтром раствор сахара непосредственно в среду. Затем привите среду, проведя по петле, полной колоний, из ранее прочерченной свежей звездной пластины E.coli BL21 и вставив петлю непосредственно в среду.
Вращайте петлю в носитель, не касаясь боковых сторон контейнера. Затем поместите инокулированную среду на ночь в инкубатор с температурой 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. На следующий день соберите клетки, переместив один литр среды в бутылку с центрифугой на один литр и центрифугируя при 5000 G от четырех до 10 градусов Цельсия в течение 10 минут.
После выброса супернатанта используйте стерильный шпатель для переноса гранулы в предварительно охлажденную и предварительно взвешенную 50-миллилитровую коническую трубку. Затем промыть гранулу один раз с 30-40 миллилитрами холодного буфера S30 путем повторного использования гранулы путем вихря в 30-секундных всплесках с периодами покоя на льду. После того, как гранула будет полностью повторно суспендирована, центрифугируйте повторное суспендирование клетки, выбросьте супернатант и, используя чистую ткань, вытрите любой избыток супернатанта с внутренних стенок 50-миллилитровой трубки, не касаясь гранулы.
Затем взвесьте гранулу перед мгновенной заморозкой в жидком азоте и храните при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Чтобы приготовить клеточный экстракт, добавьте один миллилитр буфера S30 на грамм замороженной клеточной гранулы и дайте грануле оттаять на льду в течение 30-60 минут. Затем повторно суспендируйте размороженную гранулу с помощью вихрей всплесками по 30 секунд с периодами покоя на льду, пока не останутся видимые сгустки клеток.
Для лизиса клеток перенесите 1,4 миллилитровых аликвот клеточной суспензии в 1,5-миллилитровые микрофьюжетные трубки. Затем обрабатывают ультразвуком клеточную суспензию в каждой трубке с частотой 20 килогерц и амплитудой 50% в течение трех всплесков по 45 секунд с 59 секундами отдыха за цикл в ледяной ванне Инвертировать трубку между циклами, а после последнего цикла обработки ультразвуком сразу же добавить 4,5 микролитра одномолярного дитиотрейтола. После обработки ультразвуком клеточной суспензии во всех пробирках центрифугируют трубки и собирают супернатант в 600-микролитровых аликвотах в свежие 1,5-миллилитровые микрофьюжные трубки.
Вспышка замораживает и хранит аликвоты при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Для выполнения 15 микролитров бесклеточной реакции синтеза белка в 1,5-миллилитровых микрофьюжных трубках в квадрузикате разморозьте одну аликвоту клеточного экстракта. После приготовления каждой 15-микролитровой реакционной смеси дайте реакции продолжаться не менее четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Чтобы количественно оценить репортерный белок, объедините 48 микролитров 50-миллимолярного буфера HEPES при рН 7,2 с двумя микролитрами каждого продукта реакции синтеза бесклеточного белка в черной полистирольной 96-луночной пластине. Количественно оцените интенсивность флуоресценции суперпапки зеленого флуоресцентного белка, или sfGFP, используя длину волны возбуждения 485 и длину волны излучения 528 нанометров. Затем преобразуйте относительные единицы флуоресценции в объемный выход sfGFP, создав стандартную кривую с использованием очищенной плазмиды pJL1 sfGFP.
Здесь показаны бесклеточные аутоиндукционные среды гранул после сбора клеток при различной оптической плотности, измеренной при 600 нанометрах. Среда, выращенная до оптической плотности 10, производила большее количество клеточных гранул в общем экстракте, чем среда, выращенная до оптической плотности 2,5. Дальнейший анализ общей концентрации белка не продемонстрировал существенной разницы в общем содержании белка между обоими экстрактами.
Несмотря на то, что среда была выращена до разных уровней оптической плотности, оба экстракта продемонстрировали сходные результаты в бесклеточных реакциях, экспрессирующих sfGFP. Важно поддерживать стерильные условия при приготовлении среды и раствора сахара. Этот метод клеточного экстракта CFAI может быть использован для большинства применений бесклеточной экспрессии.
Они варьируются от биотехнологического образования до белковой инженерии, а также диагностики в местах оказания медицинской помощи. Этот метод сокращает количество требуемого времени и технических навыков, улучшает воспроизводимость и производит большее количество экстракта.
