Здесь мы предоставляем подробный протокол для оценки полезных или аверсивных свойств генетической стимуляции конкретной области мозга. Техника может ответить быстро, если стимуляция конкретных клеток является полезным или обратным. Мы описываем настройки для стимулирования брюшной тегментальной области, но наши протоколы могут быть легко адаптированы для изменения конкретных параметров с точки зрения различных изучаемых регионов.
Для начала используйте однодохонные микроконтроллеры для управления лазерным источником. Загрузите скрипт на доску микроконтроллера, используя соответствующий кабель подключения к компьютеру. Скрипт включает в себя внешнюю модуляцию, исходя из программного обеспечения отслеживания через коробку TTL, и выход на лазер для управления параметрами стимуляции.
Используйте сетевой кабель для подключения коробки TTL к доске. Убедитесь, что лазер установлен для управления внешней модуляции, и подключить лазер к доске с помощью кабеля FC / PC. Подключите соответствующие булавки к наземным частям доски.
Чтобы подключить лазерный источник к оптическому волокну, сначала подключите лазерный источник к вращающемуся суставу. Подключите шнур патча к вращающейся суставу. Стабилизация вращающегося сустава над аппаратом, но за пределами зоны записи.
Убедитесь, что длина волоконно-оптического шнура патч подходит, чтобы мышь двигаться без трудностей на арене. Для калибровки установки арены используйте линейку для измерения определенной части физического аппарата. В программном обеспечении нарисуйте линию, соответствующую измеренной части.
В соответствии с шкалой рисовать для калибровки вкладки введите уже известное значение. Дизайн арены, рисовать области, где движение мышей будут записаны. Создайте зоны, нарисуйте зоны, которые в конечном итоге будут назначены в качестве лазерных пар, лазерных неоплаченных и нейтральных.
Нажмите кнопку Validate Setup, чтобы проверить настройку, чтобы подтвердить отсутствие противоречивых параметров, например, зон за пределами арены. Убедитесь, что аппаратное управление включено, и установите время эксперимента до 30 минут, чтобы повторить опцию til в настройках справочной коробки. Назначьте отсек в качестве лазерного пара, в котором вход мыши вызовет сигнал TTL через программное обеспечение отслеживания на доску микроконтроллера в настройках состояния.
Чтобы изменить настройку для нейтрального подхода предпочтений отсека, после установки арены и времени, назначьте зоны A и B в качестве лазерной пары, добавив, когда центральная точка находится в любой из зоны А и зоны B для коробки условий, связанных с настройками отсеков A и B. Чтобы настроить настройки обнаружения, используйте манекен, похожий на мышь. Поместите манекен в одном отсеке аппарата и используйте автоматизированную установку с динамическим вычитанием.
Снимите манекен и поместите его в противоположном отсеке. Убедитесь, что манекен полностью обнаружен. Поместите манекен в отсек с лазерной парой.
Чтобы проверить, работает ли стимуляция, начните приобретение с помощью ранее настроенных параметров пробного управления и посмотрите, срабатывает ли стимуляция как следует. Затем поместите манекен в неспареный или нейтральный отсек, и посмотреть, если стимуляция остановлена. Используйте ручку на лазере, чтобы установить мощность лазера до 10 милливатт.
Подключите волоконно-оптический имплантат к волоконно-оптическому шнуру с помощью керамического рукава и поместите мышь в нейтральный отсек трехкомитетного аппарата. Подождите, пока мышь не будет обнаружена программным обеспечением. Удалите вертикальные раздвижные двери, ограничивающие проникновение животного в основные отсеки.
Разрешить животному свободно исследовать без каких-либо нарушений. Весь эксперимент по предпочтению места в реальном времени проводится в течение восьми сеансов. Мышей DAT-Cre, вводимых с помощью вируса AAV channelrhodopsin EYFP в брюшной тегментальной области, были протестированы для целевой дофаминергических нейронов.
Мыши провели в среднем около 70% своего времени в лазерном парном отсеке, в отличие от непарного отсека на 20%и нейтрального отсека на 10%Противоположный поведенческий фенотип наблюдался у мышей Vglut2-Cre, введенных с AAV channelrhodopsin EYFP в брюшной тегментальной области. Мыши избегали отсека в паре со стимуляцией и проводили больше времени в неспаре. Во время условных дней ответов пять и восемь, мыши не показали явного избегания ранее парного отсека.
Чтобы еще больше продемонстрировать плодотворную или аверсивную роль конкретных нейронов, описанный метод можно похвалить другими методами, такими как оперонные парадигмы или фотогенетическая подстимуляция. Обратите внимание при обработке вирусов и при использовании лазерных источников.
