Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der lohnenden oder aversiven Eigenschaften der genetischen Stimulation einer bestimmten Hirnregion. Die Technik kann schnell beantworten, wenn die Stimulation bestimmter Zellen lohnend oder aversiv ist. Wir beschreiben das Setup zur Stimulierung des ventralen Tegmentalbereichs, aber unsere Protokolle können leicht angepasst werden, um spezifische Parameter in Bezug auf verschiedene untersuchte Regionen zu ändern.
Verwenden Sie zunächst Einplatinen-Mikrocontroller, um die Laserquelle zu steuern. Laden Sie das Skript über das entsprechende Verbindungskabel zum Computer auf die Mikrocontrollerplatine. Das Skript enthält externe Modulation, die von der Tracking-Software über eine TTL-Box kommt, und eine Ausgabe an den Laser, um Stimulationsparameter zu steuern.
Verwenden Sie ein Netzwerkkabel, um die TTL-Box mit der Platine zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Laser auf die Steuerung durch externe Modulation eingestellt ist, und schließen Sie den Laser über ein FC/PC-Kabel an die Platine an. Schließen Sie die entsprechenden Stifte an geerdete Teile der Platine an.
Um die Laserquelle mit der Glasfaser zu verbinden, schließen Sie zunächst die Laserquelle an ein Drehgelenk an. Schließen Sie ein Patchkabel an das Drehgelenk an. Stabilisieren Sie das Drehgelenk über dem Gerät, aber außerhalb des Aufnahmebereichs.
Stellen Sie sicher, dass die Länge des Glasfaser-Patchkabels geeignet ist, damit sich die Maus problemlos in der Arena bewegen kann. Um das Arena-Setup zu kalibrieren, verwenden Sie ein Lineal, um einen bestimmten Teil des physischen Geräts zu messen. Zeichnen Sie in der Software eine Linie, die dem gemessenen Teil entspricht.
Geben Sie unter der Registerkarte "Skalierung zeichnen, um zu kalibrieren" den bereits bekannten Wert ein. Entwerfen Sie die Arena, zeichnen Sie den Bereich, in dem die Bewegung der Mäuse aufgezeichnet wird. Erstellen Sie die Zonen, zeichnen Sie die Zonen, die schließlich als lasergekoppelt, laserungepaart und neutral zugewiesen werden.
Drücken Sie die Schaltfläche Setup überprüfen, um das Setup zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine widersprüchlichen Parameter vorhanden sind, z. B. Zonen außerhalb der Arena. Stellen Sie sicher, dass die Hardwaresteuerung aktiviert ist, und legen Sie die Zeit des Experiments auf 30 Minuten fest, und wiederholen Sie die Option "Til wiederholen" in den Referenzfeldeinstellungen. Weisen Sie ein Fach als lasergekoppelt zu, in dem die Eingabe der Maus ein TTL-Signal über die Tracking-Software an die Mikrocontrollerplatine unter den Einstellungen der Bedingung auslöst.
Um das Setup für den neutralen Rahmenpräferenzansatz nach arena- und Zeiteinstellung zu ändern, weisen Sie sowohl A- als auch B-Zonen als lasergekoppelt zu, indem Sie hinzufügen, wenn sich der Mittelpunkt in einer Zone A und Zone B für die Bedingungsbox befindet, die sich auf die Einstellungen für A- und B-Fächer bezieht. Um die Erkennungseinstellungen einzurichten, verwenden Sie einen Dummy, der der Maus ähnelt. Legen Sie den Dummy in ein Fach des Geräts und verwenden Sie automatisiertes Setup mit dynamischer Subtraktion.
Entfernen Sie den Dummy und legen Sie ihn in das gegenüberliegende Fach. Stellen Sie sicher, dass der Dummy vollständig erkannt wird. Legen Sie den Dummy in das lasergekoppelte Fach.
Um zu überprüfen, ob die Stimulation funktioniert, beginnen Sie mit der Erfassung mit den zuvor konfigurierten Teststeuerungseinstellungen und prüfen Sie, ob die Stimulation wie geplant ausgelöst wird. Legen Sie dann die Attrappe in das ungepaarte oder das neutrale Fach, und sehen Sie, ob die Stimulation gestoppt wird. Verwenden Sie den Knopf auf dem Laser, um die Laserleistung auf 10 Milliwatt einzustellen.
Schließen Sie das Glasfaserimplantat mit einer Keramikhülse an das Glasfaser-Patchkabel an und legen Sie die Maus in das neutrale Fach des Drei-Fach-Geräts. Warten Sie, bis die Maus von der Software erkannt wird. Entfernen Sie die vertikalen Schiebetüren, die das Tier am Betreten der Hauptfächer hindern.
Lassen Sie das Tier frei und ohne Störungen erkunden. Das gesamte Echtzeit-Platzpräferenzexperiment findet in acht Sitzungen statt. DAT-Cre-Mäuse, die mit dem AAV-Kanalrhodopsin EYFP-Virus im ventralen tegmentalen Bereich injiziert wurden, wurden getestet, um dopaminerge Neuronen ins Visier zu nehmen.
Die Mäuse verbrachten durchschnittlich etwa 70% ihrer Zeit im lasergekoppelten Fach, im Gegensatz zum ungepaarten Fach bei 20% und dem neutralen Fach bei 10%Ein entgegengesetzter Verhaltens-Phänotyp wurde bei Vglut2-Cre-Mäusen beobachtet, die mit AAV-Kanalrhodopsin EYFP im ventralen Tegmentalbereich injiziert wurden. Die Mäuse vermieden das Mitfach gepaart mit der Stimulation und verbrachten mehr Zeit in der Ungepaarten. Während der konditionierten Antworten tage fünf und acht zeigten die Mäuse keine klare Vermeidung des zuvor gepaarten Fachs.
Um die lohnende oder aversive Rolle bestimmter Neuronen weiter zu demonstrieren, kann die beschriebene Methode mit anderen Methoden wie Operonparadigmen oder photogenetischer Substimulation ergänzt werden. Achten Sie beim Umgang mit Viren und bei der Verwendung von Laserquellen.
