Qui forniamo un protocollo dettagliato per valutare le proprietà gratificanti o avverse della stimolazione genetica di una specifica regione cerebrale. La tecnica può rispondere rapidamente se la stimolazione di cellule specifiche è gratificante o avversa. Descriviamo l'impostazione per stimolare l'area tegmentale ventrale, ma i nostri protocolli possono essere facilmente adattati per modificare parametri specifici in termini di diverse regioni studiate.
Per iniziare, utilizzare microcontrollori a scheda singola per controllare la sorgente laser. Caricare lo script sulla scheda del microcontroller utilizzando il cavo di connessione appropriato al computer. Lo script include la modulazione esterna proveniente dal software di tracciamento attraverso una scatola TTL e un'uscita al laser per controllare i parametri di stimolazione.
Utilizzare un cavo di rete per collegare la casella TTL alla scheda. Assicurarsi che il laser sia impostato per il controllo tramite modulazione esterna e collegare il laser alla scheda utilizzando un cavo FC/PC. Collegare i perni appropriati alle parti di terra della scheda.
Per collegare la sorgente laser alla fibra ottica, collegare prima la sorgente laser a un giunto rotante. Collegare un cavo patch al giunto rotante. Stabilizzare il giunto rotante sopra l'apparecchio, ma all'esterno dell'area di registrazione.
Assicurarsi che la lunghezza del cavo patch in fibra ottica sia appropriata per consentire al mouse di muoversi senza difficoltà nell'arena. Per calibrare la configurazione dell'arena, usate un righello per misurare una parte specifica dell'apparato fisico. Nel software, tracciare una linea corrispondente alla parte misurata.
Nella scheda Disegna scala da calibrare immettere il valore già noto. Progetta l'arena, disegna l'area in cui verrà registrato il movimento dei topi. Create le zone, disegnate le zone che alla fine verranno assegnate come accoppiate al laser, spaiate al laser e neutre.
Premere il pulsante Convalida installazione per convalidare l'impostazione per verificare che non vi siano parametri in conflitto, ad esempio zone esterne all'arena. Assicurarsi che il controllo hardware sia abilitato e impostare l'ora dell'esperimento su 30 minuti sull'opzione ripeti fino alle impostazioni della casella di riferimento. Assegnare uno scomparto come associato al laser, in cui l'ingresso del mouse attiverà un segnale TTL attraverso il software di tracciamento alla scheda del microcontroller sotto le impostazioni delle condizioni.
Per modificare la configurazione per l'approccio delle preferenze del compartimento neutro, dopo l'impostazione dell'arena e dell'ora, assegnate entrambe le zone A e B come accoppiate al laser aggiungendo quando il punto centrale si trova in una qualsiasi delle zone A e B per la casella delle condizioni relativa alle impostazioni per i compartimenti A e B. Per impostare le impostazioni di rilevamento, utilizzare un manichino simile al mouse. Posizionare il manichino in un compartimento dell'apparecchio e utilizzare la configurazione automatizzata con sottrazione dinamica.
Rimuovere il manichino e posizionarlo nello scomparto opposto. Assicurarsi che il manichino sia completamente rilevato. Posizionare il manichino nel vano accoppiato al laser.
Per verificare se la stimolazione funziona, inizia l'acquisizione utilizzando le impostazioni di controllo di prova configurate in precedenza e vedi se la stimolazione viene attivata come dovrebbe. Quindi posizionare il manichino nello scomparto spaiato o neutro e vedere se la stimolazione è interrotta. Utilizzare la manopola sul laser per impostare la potenza del laser su 10 milliwatt.
Collegare l'impianto in fibra ottica al cavo patch in fibra ottica utilizzando un manicotto in ceramica e posizionare il mouse nel vano neutro dell'apparato a tre scomparti. Attendere che il mouse sia rilevato dal software. Rimuovere le porte scorrevoli verticali che limitano l'ingresso dell'animale nei compartimenti principali.
Consenti all'animale di esplorare liberamente senza disturbi. L'intero esperimento di preferenza del luogo in tempo reale si svolge durante otto sessioni. I topi DAT-Cre iniettati con il virus EYFP della channelrhodopsina AAV nell'area tegmentale ventrale sono stati testati per colpire i neuroni dopaminergici.
I topi hanno trascorso in media circa il 70% del loro tempo nel compartimento accoppiato al laser, a differenza del compartimento spaiato al 20% e del compartimento neutro al 10%È stato osservato un fenotipo comportamentale opposto con topi Vglut2-Cre iniettati con AAV channelrhodopsin EYFP nell'area tegmentale ventrale. I topi hanno evitato il compartimento abbinato alla stimolazione e hanno trascorso più tempo nello spaiato. Durante i giorni di risposte condizionate cinque e otto, i topi non hanno mostrato una chiara elusione del compartimento precedentemente accoppiato.
Per dimostrare ulteriormente il ruolo gratificante o avverso di specifici neuroni, il metodo descritto può essere complimentato con altri metodi come i paradigmi operoni o la sottostimolazione fotogenetica. Prestare attenzione durante la gestione dei virus e quando si utilizzano sorgenti laser.
