우리는 여기에서 특정 두뇌 지역의 유전 자극의 보람 또는 역경 속성을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특정 세포의 자극이 보람 또는 역경인 경우에 기술은 급속하게 대답할 수 있습니다. 우리는 복부 테지멘탈 영역을 자극하기위한 설정을 설명하지만 우리의 프로토콜은 쉽게 연구 된 다른 지역의 관점에서 특정 매개 변수를 변경하도록 적응 할 수 있습니다.
시작하려면 단일 보드 마이크로 컨트롤러를 사용하여 레이저 소스를 제어하십시오. 컴퓨터에 적절한 연결 케이블을 사용하여 마이크로 컨트롤러 보드의 스크립트를 로드합니다. 스크립트에는 TTL 상자를 통해 추적 소프트웨어에서 나오는 외부 변조와 자극 매개 변수를 제어하는 레이저출력이 포함됩니다.
네트워크 케이블을 사용하여 TTL 상자를 보드에 연결합니다. 외부 변조에 의해 레이저를 제어하도록 설정하고 FC /PC 케이블을 사용하여 보드에 레이저를 연결합니다. 적절한 핀을 보드의 접지 부분에 연결합니다.
레이저 소스를 광섬유에 연결하려면 먼저 레이저 소스를 회전 관절에 연결합니다. 패치 코드를 로터리 조인트에 연결합니다. 장치 위에 로터리 조인트를 안정화하지만, 기록 영역 외부.
광섬유 패치 코드의 길이가 경기장에서 어려움없이 마우스를 움직일 수 있도록 적절한지 확인하십시오. 투기장 설정을 보정하려면 눈금자를 사용하여 물리적 장치의 특정 부분을 측정합니다. 소프트웨어에서 측정된 부품에 해당하는 선을 그립니다.
보정으로 의 척도 그리기 탭에서 이미 알려진 값을 입력합니다. 경기장을 설계하고 마우스의 움직임이 기록되는 영역을 그립니다. 영역을 만들고, 결국 레이저 페어링, 레이저 페어링 및 중립으로 할당될 영역을 그립니다.
설정 유효성 검사 버튼을 눌러 설치의 유효성을 검사하여 경기장 외부의 영역과 같은 충돌하는 매개 변수가 없는지 확인합니다. 하드웨어 제어가 활성화되어 있는지 확인하고 실험 시간을 참조 상자 설정의 반복 틸 옵션으로 30분으로 설정합니다. 마우스의 항목이 조건의 설정에 따라 마이크로 컨트롤러 보드에 추적 소프트웨어를 통해 TTL 신호를 트리거하는 레이저 페어링으로 구획을 할당합니다.
중립 구획 기본 설정 접근 방식에 대한 설정을 수정하려면 경기장 및 시간 설정 후 A 및 B 영역을 A 및 B 구획의 설정과 관련된 조건 상자에 대한 영역 A 및 Zone B에 추가할 때 A 및 B 영역을 레이저 페어링으로 할당합니다. 검색 설정을 설정하려면 더미를 사용하여 마우스와 유사합니다. 더미를 장치의 한 구획에 놓고 동적 뺄셈으로 자동화 된 설정을 사용합니다.
더미를 제거하고 반대 구획에 놓습니다. 더미가 완전히 감지되었는지 확인합니다. 더미를 레이저 페어링 된 구획에 놓습니다.
자극이 작동하는지 확인하려면 이전에 구성된 평가판 제어 설정을 사용하여 수집을 시작하고 자극이 예상대로 트리거되는지 확인합니다. 그런 다음 더미를 페어링되지 않은 또는 중립 구획에 넣고 자극이 중지되었는지 확인합니다. 레이저의 노브를 사용하여 레이저 전력을 10 밀리와트로 설정합니다.
광섬유 임플란트를 세라믹 슬리브를 사용하여 광섬유 패치 코드에 연결하고 마우스를 3구 체형 장치의 중립 구획에 배치합니다. 소프트웨어에서 마우스가 감지될 때까지 기다립니다. 동물이 메인 구획에 들어가지 못하도록 제한하는 수직 슬라이딩 도어를 제거합니다.
동물이 아무런 방해없이 자유롭게 탐험 할 수 있도록하십시오. 전체 실시간 장소 환경 설정 실험은 8개의 세션동안 진행됩니다. 복부 테지멘탈 영역에서 AAV 채널로독신 EYFP 바이러스를 주입한 DAT-Cre 마우스는 도파민성 뉴런을 표적으로 테스트하였다.
마우스는 레이저 페어링 구획에서 평균 약 70%의 시간을 보냈으며, 10%에서 페어링되지 않은 구획과 10%의 중성 구획과 는 반대로 Vglut2-Cre 마우스를 복부 테그 피글 영역에서 AAV 채널로도프신 EYFP로 주입하여 관찰하였다. 마우스는 자극에 짝을 이루는 구획을 피하고 짝을 이루지 못한 곳에서 더 많은 시간을 보냈다. 조건부 응답 일 5 및 8 동안, 마우스는 이전에 페어링 된 구획의 명확한 회피를 보여주지 않았다.
특정 뉴런의 보람 또는 역경 적 역할을 더 입증하기 위해, 설명 된 방법은 오페론 패러다임, 또는 광유전학 적 자극과 같은 다른 방법으로 칭찬 될 수있다. 바이러스를 취급하는 동안 그리고 레이저 소스를 사용할 때주의하십시오.
