В vivo FPOP белково-белковые взаимодействия и структура белка меняются в C-elegans. Эти животные широко используются в качестве образцовой системы для изучения болезней человека. Путем соедать in vivo FPOP к масс-спектрометрии, мы можем зондировать взаимодействия протеин-протеина внутри по-разному клетчатые и отсеки тела в живом животном без потребности изолировать один определенный протеин.
Начните сборку системы потока, разрезая двухметровый кусок фторированного этиленового пропилена или трубки FPP. Используйте чистую вскрытии иглы, чтобы расширить внутренний диаметр на одном конце трубки, создавая небольшой кратер около 15 миллиметров в длину. Для создания вливая линий системы потока, вырезать до 15 сантиметров куски 250 микрометров внутреннего диаметра сплавленного кремнезема с керамическим резаком.
И лента двух капилляров вместе с самостоятельной клейкой лентой, убедившись, что концы 100% покраснел. Вставьте две капилляры в кратер труб FPP, толкая их до самого края. Поместите небольшую точку эпоксидной смолы на чистую поверхность и смешайте ее с вскрытой иглой.
Используйте ту же иглу, чтобы быстро поместить небольшую каплю смолы, в конце вливая капилляры, где они соединяются с трубкой FPP, позволяют смолы сухой стороне розетки вверх в течение нескольких минут. Между тем, вырезать новый 250 микрометров внутреннего диаметра капилляр, который станет выход капиллярной системы потока. После того, как смола высохла, вставьте новый капилляр к концу розетки FPP.
Внутренние концы розетки капилляров и два вливая капилляры должны быть флеш друг против друга, создавая смешивания чай. Привязать к капиллярной и FPP трубки со свежей эпоксидной смолы, как описано ранее, и позволяют системе потока высохнуть на ночь. Вставьте четыре магнитных мешалки, внутри одного пятими миллилитрового шприца, который предотвратит оседание червей в этом шприце во время быстрого фотохимического окисления белков in vivo FPOP.
Заполните этот и еще пять миллилитров шприц с M9, убедившись, чтобы избежать создания пузырьков. Подключите нижний адаптер к каждому шприцу, убедившись, что они плотно и закреплены на месте. Затем прикрепите каждый шприц к среднему порту одного клапана из трех-двух.
Защитите каждый шприц к насосу двойного шприца, и отрегулируйте механически цвет для того чтобы предотвратить overpressure от блока толкатель. Используйте супер фланг список не FEP рукав и супер фланг список переменной, чтобы прикрепить каждый вливая капиллярный конец ранее сделанной микрофлюидной системы в верхний порт каждого три-два клапана. Наконец, прикрепите к нижней порту клапана капилляр диаметром 10 сантиметров 450 микрометров, который будет служить в качестве образец капилляра.
Запустите поток насоса и визуально проинспектировать все соединения на утечки. Поток по крайней мере три объема шприца с использованием экспериментальной скорости потока. Путь потока отмечен стрелками на ручке из трех-двух клапанов, и каждый шприц может быть пополнен вручную, перемещая ручку клапана от изгнания до снятия позиции.
После осмотра микрофлюидной системы потока, переместить его на экспериментальную скамейку, и обеспечить выход капилляров на излучающую сцену с союзом из нержавеющей стали. Используйте долго достигающее зажигалку, чтобы сжечь покрытие сплавленного кремнезема в окне лазерного облучения и очистить обожженное покрытие льняной тканью и метанолом. Распоитите магнитный блок мешалки над шприцем с магнитным перемешиванием и отрегулируйте скорость, так что перемешивания вращаются медленно и постоянно.
Включите криптон фторсодержатного эксцимерного лазера и дайте тиреоиду разогреться. Измерьте лазерную энергию с частотой 50 герц, по крайней мере, для 100 импульсов, поместив оптический датчик в окно выхода луча. Вручную вывести около 10 000 червей в объеме 500 микролитров в образец шприца.
Затем заполните его 2,5 миллилитров буфера M9, убедившись, чтобы избежать пузырьков воздуха. Важно иметь размер выборки не менее 10 000 червей. Меньший размер выборки приведет к низкой урожайности белка для протеомного анализа ниже по течению.
Заполните второй шприц тремя миллилитров 200 миллимолярной перекиси водорода. В конце розетки капилляр, место 15 миллилитров конической трубки с шестью миллилитров 40 миллимолярный DMTU, 40 миллимолярный PBN, и 1%время оксида яблочного пюре. Запустите excimer лазер из окна программного обеспечения, ждать первого импульса и начать образец потока из двойного шприца.
Соберите весь образец в 15 миллилитровой трубке, при этом активно отслеживая поток образца для любых визуальных утечек. После in vivo FPOP, гранулы червей центрифугации в 805 раз г в течение двух минут. Аспирировать раствор утоления и добавить 250 микролитров лицензированного буфера.
Перенесите образец в чистую микро центрифугу, заморозьте его и храните при отрицательном 80 градусах Цельсия до усвояемости образца. восстановление червя было сравнено после in vivo FPOP с использованием капилляров с двумя различными внутренними диаметрами. При использовании капилляра внутреннего диаметра 250 микрометров общее восстановление выборки между 63 и 89% было достигнуто в двух биологических репликациях.
Использование капилляра внутреннего диаметра 150 микрометров привело лишь к восстановлению от 21 до 31%. Использование больших капилляров внутреннего диаметра, приводит к лучшему потоку червей во время in vivo FPOP, меньше капилляров не позволяет для одного потока червя, и несколько червей видели течет вместе на лазерное излучающих окно, что уменьшает количество лазерного воздействия на червя. Представитель извлеченных ионных хроматограмм FPOP модифицированных и неизмененных пептид показал, что гидроксил радикал изменения химии окислительно модифицированных пептидов, что делает их более полярными.
В обратной фазе хроматографии модифицированные пептиды in vivo FPOP имеют более раннее время удержания, чем неизмененные пептиды. MS фрагментация изолированных пептидов, позволяет идентифицировать окислительно модифицированных остатков. In vivo FPOP окислительно модифицировал в общей сложности 545 белков в двух биологических репликациях в C-elegans.
Одним из преимуществ этого метода след белка, является его способность изменять белки, в различных системах организма в червей. Тандем MS анализ подтверждает in vivo FPOP зонд растворитель доступности in vivo. Была проанализирована структура окисления белка теплового шока 90 в комплексе с миозином, сопровождаемым белком UNC 45, и были обнаружены четыре окислительно модифицированных остатка.
Использование C-elegans для in vivo FPOP, предлагает потенциал для изучения роли белково-белковых взаимодействий и структуры белка в патогенеза болезни.
