Лазерное воздействие гидроксильных радикалов на белок значительно облегчает идентификацию участков белкового взаимодействия и областей подтверждающих изменений, ускоряя исследования в исследованиях агрегации, структуры и стабильности белка. С помощью встроенной радикальной дозиметрии пользователи могут регулировать эффективную гидроксильную радикальную нагрузку в режиме реального времени, а с помощью радикальной дозиметрии в реальном времени вы можете сэкономить экспериментальное время и драгоценный образец, одновременно улучшая воспроизводимость маркировки. Для начала расщеплите капилляр кремнезема внутреннего диаметра 250 микрометров до 27 дюймов с помощью камня, расщепляющего кремнезем, проверяя концы капилляра для чистого и прямого среза.
Создайте два окна длиной примерно 15 миллиметров. От нижнего конца капилляра сожгите полиимидное покрытие на 90 миллиметров вверх, чтобы создать окно фотолиза и 225 миллиметров для окна дозиметра. Вставьте нижний конец капилляра сразу за коническим концом гайки и наконечника.
Добавьте капилляр к пятому порту, затягивая сразу за пальцем гаечный ключ. Снимите крышку фотолизной ячейки модуля фотолиза, вытащив ее прямо, затем снимите магнитно установленную металлическую маску, которая будет удерживать капилляр на месте. Откройте ячейку дозиметра, нажав на выступ слева, и покачайте ячейку дозиметра открытой вправо.
Снимите магнитные зажимы, которые будут удерживать капилляр на месте. Затем поместите капилляр в рифленый канал у основания фотолизной ячейки и центрировать капиллярное окно с окном ячейки фотолиза. Удерживайте капилляр в положении и добавьте магнитную маску.
Верните колпачок фотолиза обратно в положение. Поместите капилляр в рифленый канал у основания дозиметрической ячейки и центрите второе капиллярное окно на небольшом отверстии в центре ячейки дозиметра. Удерживая капилляр в нужном положении одной рукой, поместите два магнитных зажима в положение, чтобы удерживать капилляр на месте.
Закройте ячейку дозиметра до щелчка мышью. Наконец, вставьте капилляр через накатную ручку поверх капиллярного подъемника коллектора продукта, расширяя капилляр чуть выше дна флакона. Отрежьте нужную длину тефлоновой трубки с помощью фрезы и проверьте концы на наличие чистого прямого среза.
Вставьте один конец новой петли впрыска через одну из гаек и поместите новый наконечник на конец трубки. Держите гайку и наконечник на месте, вставляя трубку в шестой порт инжекционного клапана, пока он не вылетит на дно. Затяните гайку гаечный ключ, затем убедитесь, что гайка и наконечник надежно на месте.
Как только оба конца имеют гайку и фиксированный наконечник, свободно прикрутите один конец к третьему порту, а другой конец к шестому порту. Оказавшись в положении, затяните обе стороны до плотного пальца, затем на четверть поверните мимо пальца тугой с помощью ключа. Включите систему HRPF без лазера, запустив модуль флюидиики, за которым следуют модуль фотолиза, модуль дозиметра, коллектор продукта и системный компьютер.
Запустите системное программное обеспечение. Полностью погружите трубку в 10 миллилитров буфера из положения клапана на шприцевом насосе. Направьте трубку из положения отходов, а трубку из второго порта на шприцевом порту в пустой контейнер для сбора отходов.
Поместите 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки в положение с маркировкой HN6 на карусели коллектора продукта. Промывайте инжекторную петлю пять раз, впрыскивая 25 микролитров воды класса ВЭЖХ с клапаном, установленным в положение нагрузки. Вручную поверните инжекторный клапан, чтобы промыть остальную часть системы.
Выберите Процесс в управляющем программном обеспечении, чтобы начать течь воду до тех пор, пока не образуется капля. Делают раствор, содержащий два миллимоляра аденина и 10 микромолярный белок. Затем делают раствор для закалки, используя 0,3 миллиграмма на миллилитр каталазы и 35 миллимоляров метианинамида.
Aliquot 25 микролитров раствора для закалки в микротрубку 200 микролитров. Разбавить перекись водорода до 200 миллимолар, сохранив ее на льду. Запустите напряжение вспышки при нулевых вольтах на управляющее программное обеспечение.
Этот нулевой вольтовый контроль будет определять любое фоновое окисление на интересуемом белке. Выберите Запустить данные AutoZero, а затем Обработать, а затем Готово. Наконец, поверните инжекторный клапан вниз в положение нагрузки.
Поместите раствор для закалки в положение один на карусели коллектора продукта, затем измените флакон продукта на один в программном обеспечении управления системой. Непосредственно перед инъекцией смешайте 12,5 микролитра смеси аденина и белка с 12,5 микролитрами перекиси водорода. Пипеткой смесь вверх и вниз перемешайте, затем быстро раскрутите ее вниз.
Ввести 25 микролитров этого раствора с помощью инъекционного порта в течение 10 секунд после смешивания. Переключите инжекторный клапан в положение впрыска и подождите, пока образец обрабатывается. Включите напряжение вспышки до 750 вольт на управляющей программе и повторите шаги маркировки.
Затем запишите поглощение каждого образца. Сначала нажмите «Выбрать», затем вручную выберите начало и конец пикового поглощения. В доступном пространстве напишите в описание образца.
Повторите это для всех полученных данных. Скопируйте и вставьте данные в электронную таблицу, чтобы рассчитать среднее изменение поглощения аденина для каждого напряжения. После того, как все образцы будут собраны, промывайте шприц-порт и контур образца, установив инжекторный клапан в положение нагрузки, и впрыскивайте 25 микролитров воды ВЭЖХ пять раз.
Поверните инжекторный клапан в положение впрыска, чтобы промыть остальную часть системы водой ВЭЖХ. После промывки остановите поток, выйдите из программного обеспечения управления системой и выключите модули, начиная с коллектора продукта, модуля дозиметра, модуля фотолиза и, наконец, модуля флюидики. После окисления аденин, используемый для дозиметрии, уменьшает поглощение ультрафиолетовым излучением на 265 нанометров.
Буфер 2 содержит радикальный поглотитель, который уменьшает изменение абсорбентности аденина по сравнению с буфером 1. Апомиоглобин модифицировали в присутствии перекиси водорода и аденина при четырех возрастающих напряжениях плазменной лампы. Было обнаружено шесть пептидов, с линейным увеличением окисления относительно изменения абсорбирующей аденина на 265 нанометров.
Эти шесть окисленные пептиды помечены на кристаллической структуре миоглобина. Степень окисления, обнаруженного плазменной лампой высокого давления, намного выше, чем лазерным методом. Это увеличение связано с широким спектром ультрафиолетового излучения плазменной лампы высокого давления.
Производя широкий спектр ультрафиолета, плазменная лампа высокого давления лучше перекрывает область поглощения перекиси водорода, что приводит к более эффективному производству гидроксильных радикалов путем фотолиза перекиси водорода по сравнению с эксимерным лазером Kr F и лазером Nd YAG. Плазменная лампа высокого давления значительно увеличивает производство гидроксильных радикалов сверх того, что обычно наблюдается с помощью эксимерного лазера Kr F. Использование 100 миллимолярной перекиси может вызвать высокий уровень фонового окисления.
Если белковая система восприимчива к перекисному окислению, уменьшите концентрацию до 10 миллимоляров. Необратимая метка HRPF позволяет обрабатывать образцы, включая длительное сбраживание протеазы, вы можете добавить тандемную массовую метку для мультиплексирования и выполнить 2D-хроматографию, улучшая обнаружение пептидов и консоординат структурной информации.
