Используя наш протокол, многослойность жидких разбавлений биоотвода не только способствует однородной дисперсии инкапсулированных клеток, но и поддерживает биоинквую среду, подходящую для клеток. Мы используем межрасовое напряжение, чтобы остановить осаждение инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре, избегая высокой нагрузки снятия стресса на клетки во время экструзионные печати. Используя эту технологию, мы можем генерировать 3D ткани конструкций с однородной распределения клеток, обеспечивая функциональный in vitro ткани формы для использования в скрининга наркотиков и регенерации медицины исследований.
При подготовке биоинки важно обращать внимание на экспериментальную температуру и процедуру погрузки гигрогеля, так как эти факторы могут повлиять на качество чернил. Перед началом подготовки используйте 0,22-микрометровый шприц-фильтр для стерилизации всех материалов и растворяете желатин до 10%окончательной концентрации в 50-градусной-цельсийной PBS в кабинете биологической безопасности. Добавьте метакриический ангидрид в раствор желатина при соотношении веса 0,6 к одному с медленным перемешиванием в течение по крайней мере одного часа при 50 градусах Цельсия.
В конце инкубации перенесите смешанный раствор в стерильную 50-миллилитровую трубку и разделите раствор на слои центрифугой. Соберите верхний слой GelMA и разбавьте собранный раствор двумя томами деионизированной воды 40-50 градусов по Цельсию. Диализ решение GelMA с 12 до 14-килодальтон молекулярного веса отсечения диализа мембраны против деионизированной воды в течение пяти-семи дней при 40 до 50 градусов по Цельсию, изменяя воду два раза в день.
В конце диализа заморозьте раствор GelMA при температуре минус 80 градусов по Цельсию за одну ночь. Далее лиофилизируйте раствор GelMA в течение трех-пяти дней в заморозке при температуре минус 45 градусов по Цельсию и 0,2 миллибара давления. Затем растворите лиофилизированный гельма в PBS, дополненный 10%-фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 25 миллимолярем HEPES и 0,5%фотоинициатором.
Для получения биоинкс шелкового фиброина GelMA смешайте раствор GelMA с различными объемами исходного раствора фиброина шелка и различными объемами PBS, как это предлагается в таблице. Когда все биоинки были подготовлены, sonicate раствор в течение 10 до 20 минут. В то время как чернила sonicating, собирать клетки из 80% стечения NIH/3T3 клеточной культуры в один 15-миллилитровый конической трубки на биоинк раствор, и гранулы клеток центрифугации.
Затем тщательно аспирировать supernatants и повторно использовать клетки в каждой трубке с двумя миллилитров биоинка в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр биоинк раствора концентрации. Чтобы загрузить биоинк для печати, добавьте аспират 400 микролитров клеточного шелкового фиброина 0,5 ГельМА в нижний слой двухми миллилитрового шприца. Поместите шприц в ванну с ледяной водой с нулевым градусом по Цельсию в течение пяти минут, чтобы преобразовать биоинк нижний слой в гельное состояние перед загрузкой 400 микролитров клеточного фиброина шелка 0,75 биоинкуса GelMA над слоем шелкового фиброина 0,5 Гельма.
Затем верните шприц в ледяную ванну в течение пяти минут, продолжая добавлять каждую дополнительную концентрацию клеточного био цинка в шприц таким же образом. Когда многослойная биоинковая система с различными концентрациями шелкового фиброина в различных слоях была достигнута, разогреть биоинк в 37-градусный инкубатор по Цельсию в течение 30 минут. В конце инкубации загрузите 27-калибровочный печатный сопло на шприц и установите скорость потока до 50 микролитров в минуту, скорость перемещения сопла до двух миллилитров в секунду и высоту сопла до одного миллиметра.
Далее печать ткани построить в экструзии образом с помощью изготовленного на заказ биопринтера при комнатной температуре, и перекрестное соединение биопечатной ткани построить с 365 нанометров ультрафиолетового света в течение 40 секунд при 800 милливатт. Затем культура перекрестной ткани построить в DMEM дополняется 10%fetal быvine сыворотки и 1%пенициллин-стрептомицин в инкубаторе клеточной культуры, изменение среды каждые восемь часов в течение первых двух дней и каждые два-три дня после этого. В этом репрезентативном анализе по мере развития процедуры биопечати плотность клеток в целевых скважинах снизилась во всех группах.
В шелковой фиброин нулевой группе GelMA, около 70% клеток были отложены в нижнем слое. В шелковом фиброине одной группы GelMA, приблизительно 40% клеток были отложены в нижнем слое, и приблизительно 5% клеток были отложены в верхнем слое. В группе многослойных многослойных шелковистых фиброин Гельма осаждение инкапсулированных клеток было более однородным, чем у контрольных групп.
Наиболее важной частью этого протокола является загрузка многослойных биослойных систем SF-GelMA. Этот протокол может быть применен к другим экструзии биопечати анализа, которые используют жидкие биоинки.
