Наш протокол использует обычные флуорофорные зонды и простые методы подготовки образцов, которые поддерживают изображение клетки в физиологическом состоянии для изучения высокодинамичных клеточных процессов и подробных субклеточных структур. Этот метод позволяет исследовать клеточные процессы в сверхвысоком разрешении и в физиологических условиях в течение длительного периода без ущерба для специального или временного разрешения. Начните с разрезания отрезанной диализной мембраны с молекулярной массой от 12 до 14 килодалтон на мелкие кусочки и замачивания кусочков 100 микролитрами среды живых клеток в течение примерно пяти минут.
Пока мембраны замачивания, разрежьте наружное кольцо 50-миллилитровой трубки на мелкие кусочки и стерилизуйте кусочки в 70% этаноле. Для рассечения и крепления яичек переложите десять двух-трехдневных обезболивающих самцов в рассеченную посуду под рассекающим микроскопом и используйте тонкие щипцы для удаления яичек. Когда все яички будут собраны, вымойте яички два раза в среде живых клеток и используйте наконечник пипетки, чтобы распределить от 100 до 150 микролитров живой клеточной среды на приготовленную стеклянную нижнюю посуду.
Используйте тонкие щипцы, чтобы перенести яички мухи в центр тарелки и удалить все, кроме около 10 микролитров среды. Быстро поместите предварительно влажную мембрану на яички и поместите на мембрану два-три небольших пластиковых груза. Сразу же добавьте от 100 до 150 микролитров свежей среды живых клеток и поместите кольцо обратно на приподнятую сторону блюда.
Поместите крышку обратно на кольцо и закрутите лист папиросной бумаги в воде, прежде чем положить бумагу на крышку. Затем накройте блюдо крышкой и закрепите блюдо на сцене микроскопа сверхвысокого разрешения. Для визуализации стволовых клеток зародышевой линии откройте программное обеспечение для визуализации и включите проходящий свет.
Используйте объектив 63X, чтобы сосредоточиться на ткани яичек и включить лазеры. Нажмите Live», чтобы найти зародышевые стволовые клетки. Отрегулируйте фокус и нажмите «Размер кадра», чтобы установить размер кадра в диапазоне от 512 до 512 до 1024 на 1024 пикселя, и «Усреднение», чтобы установить среднее значение кадра на один или два.
Нажмите Master Gain, чтобы установить коэффициент усиления умножения электронов на менее 800, и Lasers, чтобы установить мощность лазера на 1%-2%Увеличить масштаб до интересующей области или ячейки, чтобы сократить время получения изображения и уменьшить отбеливание фотографий, и подтвердить, что изображение было оптимально настроено, прежде чем нажать Начать эксперимент», чтобы начать захват изображения с замедленной съемкой. Если Airyscan Acquisition не настроен оптимально, щелкните «Оптимальный» в разделах «Размер кадра», «Z-стек» и «Область сканирования» и оптимизируйте временной интервал, количество Z-срезов и продолжительность покадровой визуализации в соответствии с экспериментальным дизайном и типом образца. После создания образа выберите «Обработка», «Пакетная обработка» и «Обработка Airyscan», а затем выберите изображения для обработки.
Затем нажмите «Выполнить процесс», чтобы получить изображения с сверхвысоким разрешением. Визуализация живых клеток яичек дрозофилы, экспрессирующих альфа-тубулин GFP в половых клетках на ранней стадии с использованием конфокального микроскопа вращающегося диска, позволяет визуализировать асимметричную интенсивность сигналов GFP в двух центросомах, как более яркий сигнал в материнской центросоме и относительно более слабый сигнал в дочерних центросомах. Разница в яркости, вероятно, отражается временной асимметрией ядра микротрубочек, но подробная морфология и количество микротрубочек не могут быть решены с помощью конфокальной микроскопии вращающегося диска.
Напротив, визуализация с супервысокими живыми клетками позволяет визуализировать и количественно определять морфологию и числа микротрубочек. Это улучшенное разрешение также выявляет закономерности асимметричного зародышка микротрубочек, удлинения и повышенного взаимодействия с ядерной мембраной. Визуализация живых клеток также позволяет визуализировать асимметричную инвагинацию ядерной мембраны, но не отдельных микротрубочек, которые непосредственно входят в ядро.
Напротив, этот метод сверхвысокого разрешения живых клеток позволяет непосредственно наблюдать за этими событиями путем одновременной визуализации как микротрубочек, так и ядерной пластинки. Во время метафазы обе сестринские центромеры могут быть обнаружены как один сигнал с помощью вращающейся дисковой микроскопии, хотя центральное прикрепление микротрубочек не может наблюдаться. Напротив, живая визуализация с сверхвысоким разрешением позволяет визуализировать прикрепление микротрубочек центромеры в ранней профазе.
Обязательно поместите мембрану над яичами, чтобы убедиться, что они не двигаются или не плавают во время визуализации, и оптимизируйте настройки микроскопа, чтобы избежать фотоотбеливания и фототоксичности. Есть много способов, которыми этот метод может быть применен, например, для исследования динамики белка, линейного напряжения или клеточной защиты и процессов.
