Acyl-resin assisted capture или Acyl-RAC является чувствительным и надежным методом, который может быть использован для обнаружения белка S-acylation в различных биологических образцах. Этот протокол обходит некоторые ограничения метаболической маркировки и радиосвязи, а также позволяет одновременно обнаруживать S-ациляцию нескольких белков. Не только живые клетки, но и первичные ткани и замороженные образцы.
S-acylation может регулировать различные клеточные процессы, такие как торговля белками, плазменная мембрана ориентации, трансдукция сигнала, транспортировка железа, и белково-белковых взаимодействий. Важно использовать свежеприготовленный раствор гидроксиламина с тщательно скорректированным рН для каждого эксперимента, чтобы обеспечить эффективное и специфическое расщепление тиоэстерной связи. С демонстрацией этого метода очень важно для таких шагов, как хлороформ, метанол осадков.
Гранулы блинной формы, полученные во время этого шага, должны обрабатываться очень осторожно. Это может быть хрупким и частичная потеря образца во время шага может привести к неравномерному восстановлению выборки. Демонстрацией процедуры будет Саванна Уэст, аспирант нашей лаборатории.
Чтобы получить лизы клеток, соберите клетки, представляющие интерес в коническую центрифугу трубки. И удалите любой клеточный мусор путем центрифугации. Вымойте гранулы в 5 миллилитров PBS.
И сразу же повторно помесить клетки в 600 микролитров свежеприготовленного буфера лиза. Агитировать образец на 1500 оборотов в минуту в термо шейкер в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. Перед очисткой ликатов, гранул моющего средства и растворимого материала центрифугированием.
В конце центрифугации соберите очищенный лизат в предварительно охлажденные 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду. И выполнить Брэдфорд или бицинхониновой кислоты анализ для оценки концентрации белка в соответствии со стандартными протоколами. Добавьте метанол и хлороформ к лисату при соотношении 2:1.
Встряхните строго, чтобы создать однородную суспензию и центрифугу образца, чтобы собрать белковые гранулы на стыке между аквеозной и органической фазами. Наклоняя трубку, используйте иглу или наконечник погрузки геля, чтобы аспирировать как можно больше растворителя. Воздух высушит белковые гранулы в течение нескольких минут.
Перед тем, как аккуратно смешать содержимое трубки с 600 микролитров метанола, заботясь, чтобы не разбить гранулы. После тщательного удаления метанола мыть, высушить белковые гранулы на скамейке верхней около пяти минут. Далее, повторное потребление белковых гранул в 200 микролитров буфера 2SHB.
И вихрь при 42 градусах Цельсия и 1500 оборотов в минуту в термо шейкере. Когда гранулы растворяются, добавьте в образец 200 микролитров 0,2%MMTS в 2SHB. И инкубировать белок в течение 15 минут при 42 градусах Цельсия и 1500 оборотов в минуту в термо шейкере.
В конце инкубации выполнить 3:4 хлороформ-метанол осадков, как попродемонстрировано. Чтобы удалить MMTS, растворите гранулы в 100 микролитров свежего буфера 2SHB с вихрем. И разбавить образец 300 микролитров буфера А после каждого осадка.
После окончательного осадка растворите образцы в 200 микролитров буфера 2SHB и разбавьте 240 микролитров буфера A.Измерьте концентрацию белка снова и отложите 40 микролитров из каждого образца в качестве входного контроля. Разделите образцы на два равных тома по 200 микролитров. И отметь трубки как плюс гидроксиламин и минус гидроксиламин.
Добавьте 50 микролитров свежеприготовленных нейтральных двух толярных гидроксиламинов в окончательную концентрацию 400 миллимоляров в плюс гидроксиламиновую трубку. И 50 микролитров нейтральных двух молярных хлорида натрия к отрицательному контролю, минус гидроксиламиновая трубка. Затем добавьте 30 микролитров навоза шарика TS в каждую трубку.
И поверните трубки на один-два часа при комнатной температуре. В конце инкубации мыть бисер четыре раза с 1%SDS в буфере, чтобы удалить любые остаточные гидроксиламин. После последней стирки, мыть все образцы бисера с тремя нежными одну минуту микроцентрифугации.
Тщательно аспирации supernatants и resuspending бусы в 500 микролитров 1%SDS в буфере А при каждой стирке. После последнего мытья, осторожно спина вниз бисера, как попродемонстрировано. И аспирировать как можно больше супернатантных, насколько это возможно, не нарушая бисера.
Чтобы восстановить белки из бисера, добавьте 50 микролитров буфера образца 4%SDS в каждую трубку и инкубировать образцы при 80 градусах Цельсия и 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут в термо шейкере. В конце инкубации, дайте образцам остыть перед центрифугой, чтобы полностью гранулировать бисер. Затем используйте наконечник загрузки геля для переноса элеваторных белков в новые 1,5 миллилитровые трубки.
И запустить образцы на SDS-PAGE гель для анализа S-ацилляции белков, представляющих интерес для западных blotting. Тирозинкиназа Lck может быть обнаружена в лизатах, обработанных нейтральными двумя молярными гидроксиламинами. чтобы расщепить связь тиоэстер между остатками цистеин и жировых кислот moiety.
Зачистка и reprobing с антителами против белков Fyn и LAT показывают, что ацил-смола помощь захвата анализ может быть использован для анализа S-ацилляции нескольких белков в то же время. Кроме того, S-ациляция Lck, Fyn и LAT может быть легко обнаружена в первичных сплайкоцитах мыши. Указание на то, что эта модификация сохраняется между двумя видами.
В дополнение к идентификации новых S-acylated белков, этот метод также может быть использован для оценки изменений в белке S-ацилляции в различных биологических условиях. Количество вновь выявленных S-acylated белков значительно увеличилось после двойного вверх означало быстрый, и надежный метод, такой как Acyl-RAC. В дополнение к идентификации новых S-acylated белков, этот метод также может быть использован для оценки изменений в белке S-ацилляции в различных биологических условиях.
