Этот протокол важен, так как позволяет выявить взаимодействие растений и грибков. Помимо окрашивания пектина, он также демонстрирует дефекты на полимере клеточной стенки патогена и позволяет идентифицировать грибковые структуры. Этот простой и несложный метод может быть выполнен с использованием световой микроскопии и не требует какого-либо дорогостоящего оборудования, такого как сканирующий электронный микроскоп.
Кроме того, это быстрая методика, которая получает отличное отличие растительных структур для гистопатологических исследований. Методика идентифицирует взаимодействие растения и гриба. Следовательно, он сотрудничает для диагностики заболеваний, вызванных биотрофными и некротрофными грибами, такими как кофейная ржавчина и церкоспориоз.
Для начала соберите и примерно 10 квадратных миллиметров образца листа в средней области поражения с помощью скальпеля и пинцета, и погрузите его в 30 миллилитров карновского фиксирующего раствора. Подвергайте образец листа низкому вакууму от 500 до 600 миллибар в течение 15 минут с помощью масляного насоса, по крайней мере, в четыре раза, чтобы увеличить проницаемость фиксирующего раствора в ткани листа. После фиксации промыть образец листа три раза в 0,5 М какодилатного буфера, разведенного в дистиллированной воде в течение пяти минут каждый, а затем перенести его в градуированный этанольный ряд в течение 15 минут при каждой концентрации этанола.
Для постепенного переноса образцов на метакрилат гликоля получают раствор А путем смешивания одного грамма порошка метакрилата гликоля со 100 миллилитрами основной смолы при магнитном перемешивании. Затем погружают образцы в соотношении один к двум раствора А и 100% этанола в течение трех часов. Погружают образцы в соотношении один к одному для раствора А:100% этанола в течение трех часов, затем погружают в чистую основную смолу на два-четыре дня.
Подвергайте образец низкому вакууму не менее четырех раз в день в течение 15 минут с последующим вращением. Смешайте 15 миллилитров раствора А с одним миллилитром отвердителя в стакане с вращением в течение двух минут для получения раствора полимеризации B.Поместите 1,2 миллилитра этого раствора полимеризации B в пластиковые формы. Используя деревянную кирку, перенесите поврежденные образцы листьев из чистой основной смолы в раствор B и избегайте использования пинцета, поскольку они могут вызвать раздавливание тканей.
Обеспечьте быструю ориентацию образцов листьев перпендикулярно пластиковым формам, так как раствор В быстро становится вязким. Когда перпендикулярная ориентация образцов листьев достигнута, подождите 30 минут, а затем перенесите пластиковую форму в пластиковую или стеклянную камеру, содержащую силикагель, чтобы предотвратить влажность. После того, как смола и образец листа полимеризуются через два-три часа, отделите полученный блок от пластиковой формы, отшлифовав основание блока шлифовальным файлом.
Затем приклейте блок к куску дерева. Разрежьте блок на участки толщиной пять микрометров с помощью вращающегося микротома, оснащенного восьмисантиметровыми стальными лезвиями. Поместите секции на стеклянные горки, покрытые дистиллированной водой.
Затем перенесите слайды на конфорку, чтобы высохнуть при температуре 40 градусов Цельсия и способствовать адгезии секций к стеклянным слайдам. После высыхания пометьте стеклянные слайды ссылочным именем блока и номером слайда. Накройте секции двумя миллилитрами 5%-хлопчатобумажного синего цвета лактофенолом и нагрейте их на конфорке при 45 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Удалите лишний краситель, промыв горку три раза в стакане, наполненном дистиллированной водой. Окрасьте его двумя миллилитрами 0,01% рутения красного цвета в воде в течение одной минуты. Удалите лишний краситель, промыв горку три раза в стакане, наполненном дистиллированной водой.
Нанесите каплю дистиллированной воды на секции и накройте секции крышкой для выполнения анализа световой микроскопии. В методе двойного окрашивания гифы Hemileia vastatrix, содержащие клеточные стенки и плотное содержание протопластов, казались темно-синими как в губчатой, так и в частоколовой паренхиме. Материнская клетка хаусториума и хаустория также имели темно-синий цвет.
Встречное окрашивание рутением красным цветом четко определяет распределение грибков в межклеточных пространствах. Во время взаимодействия материнская клетка Hemileia vastatrix haustorium сломала клеточную стенку хозяина и развила хаусториальную шейку, окруженную пектическими соединениями. Богатая пектинами розово-красная инкапсуляция шеи хаусториального цвета не может предотвратить гаусториальное образование.
В некоторых случаях богатая пектинами инкапсуляция заключала хаусториум неполностью. А в некоторых случаях хаусториум полностью инкапсулирован. Богатая пектинами клеточная стенка сохраняет целостность на границе поражения, где грибок отсутствует.
Метод двойного окрашивания продемонстрировал наличие межклеточных гиф. В зонах взаимодействия пектиновые клеточные стенки, по-видимому, теряют свою целостность из-за растворения. Репродуктивные структуры, такие как конидии, были обнаружены в адаксиальном эпидермисе.
Cercospora coffeicola hyphae были обнаружены в субстоматической камере в виде скручивающихся структур, а паренхима частокола в области поражения, по-видимому, подвергается лизису клеточной стенки. Избегайте использования пинцета, так как он может вызвать раздавливание тканей. Дальнейшие гистопатологические исследования ржавчин, антракноза, церкоспориоза, головни и других биотрофических, гемибиотрофных и некротрофных растительно-грибковых взаимодействий должны быть проведены для изучения потенциального использования этого метода в различных патосистемах.
