Здесь мы представляем подробный протокол для изоляции эндокардных клеток и коронарных эндотелиальных клеток отдельно от сердца, чтобы помочь людям понять экспрессию и функцию генов типа клетки. Основными преимуществами этого метода являются высокая чистота и жизнеспособность изолированных ЕЭК и ЭКВ и то, что клетки сохраняют свои физиологические свойства при изоляции. CECs и EECs отличают в много аспектов, поэтому способность независимо исследовать эти населенности клетки позволяет исследовать тип-специфические механизмы клетки в различных заболеваниях сердца.
Этот метод может облегчить изучение транскриптономических и эпигенетических факторов, ответственных за многочисленные болезни сердца в клеточном типе конкретных образом. Самые сложные части этого метода определяют различные части сердца и сроки пищеварения правильно, чтобы избежать загрязнения типа клетки. Демонстрацией процедуры будет Ифэй Мяо, научный сотрудник из моей лаборатории.
После сбора сердца от шести 50 до 100 грамм Sprague Dawley крыс, мыть органы с 50 миллилитров холодного HBSS три раза, чтобы удалить излишки крови и поместить одно сердце под рассечение микроскопа. Распоистите сердце на его более плоском заднем лице, чтобы определить левую и правую стороны ткани и найти легочную артерию. Используйте ножницы, чтобы прорезать легочную артерию до правой желудочковой камеры и вырезать вдоль перегородки, пока вершина не будет достигнута.
Продолжить резки от вершины до задней стороны сердца вдоль перегородки, пока соединение легочной артерии и правой желудочковой камеры не будет достигнута. Начиная с этой точки, вырезать как передней и задней стороны сердца перпендикулярно предыдущей точки вскрытия и от перегородки, пока правой желудочковой свободной стенки освобождается от остальной части сердца. Затем поместите право желудочковой свободной стены в пять миллилитров трубки DMEM и найти аорты снова для облегчения сбора левого желудочка свободной стенки таким же образом, как только что продемонстрировали.
Когда все желудочков свободные стены были собраны, передать образцы тканей в 60 сантиметров культуры блюдо с их внутренней поверхности лежал лицом вниз в блюдо. Используя один миллилитровый наконечник пипетки, добавьте 0,5-1 миллилитр буфера пищеварения к блюду прямо под кусочками ткани, пока не будут погружены только внутренние поверхности тканей. Чтобы избежать нежелательного загрязнения клеток, важно, чтобы только внутренняя поверхность желудочка была погружена в буфер пищеварения и переваривалась ровно пять минут.
После пяти минут в инкубаторе клеточной культуры, остановить пищеварение с пяти раз объем эндотелиальной клеточной среды. Затем используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы промыть внутреннюю поверхность каждого желудочка со свежей средой, передавая сток через 40-метровый ситечко в 50-миллилитровую трубку сбора на льду. Для пищеварения коронарных эндотелиальных клеток, вырезать вдоль внешней поверхности левого желудочка без загрязнения от внутреннего слоя и поместить каждый фрагмент трубки в отдельной пятими миллилитрной трубки, содержащей один миллилитр буфера пищеварения.
Чтобы избежать загрязнения от ЭИК, важно только вырезать из внешней поверхности желудочка. Используя ножницы для вскрытия, измельчите желудочковой стенки на мелкие кусочки одного кубического миллиметра и поместите трубки в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 15-20 минут с вихрем каждые две-три минуты. Когда рубленые кусочки небольшие, но видимые, добавьте четыре миллилитров эндотелиальной клеточной среды в трубку и используйте пятими миллилитровую серологическую пипетку, чтобы передать весь объем раствора через 40-метровый ситечко в 50-миллилитровую трубку для сбора на льду.
Чтобы изолировать положительные популяции клеток CD31 после их пищеварения, гранулировать клетки центрифугой и аспирировать супернатанты. Если какие-либо гранулы красные, повторного анализа клеток в один-два миллилитров красных кровяных телец лиза буфера на трубку в течение пяти минут инкубации в 37 градусов по Цельсию водяной бане. В конце инкубации остановите лиз с 10 миллилитров PBS и соберите клетки со второй центрифугации.
Далее добавьте 90 микролитров буфера сортировки и 10 микролитров антител anti-CD31 PE к каждой трубке клеток. После вихря, инкубировать клетки в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации добавьте 10 миллилитров буфера сортировки в трубки с тщательным смешиванием и соберите клетки путем центрифугации.
Повторное добавление гранул в 80 микролитров буфера сортировки на трубку, а затем добавление 20 микролитров анти-PE микробусов. После вихря, поместите трубки на четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут, а затем мыть в 10 миллилитров сортировки буфера центрифугации, как только что продемонстрировали. Повторное выделение гранул в 500 микролитров сортирования буфера на льду и место столбец, содержащий супер парамагнитных сфер в магнитный сепаратор.
Промыть столбец тремя миллилитров буфера сортировки. Когда столбец опустеет, добавьте 500 микролитров эндокардиальной эндотелиальной клеточной подвески к столбец, а затем четыре моет с тремя миллилитров сортировки буфера на стирку. После последней стирки перенесите колонку в новую трубку сбора 15 миллилитров и используйте колонку поршень и пять миллилитров свежей эндотелиальной среды клеток, чтобы промыть CD31 положительные клетки из колонки в трубку сбора.
Затем соберите бисер изолированных эндотелиальных клеток центрифугации. Как и предсказывалось, количественный ПЦР показывает, что по отношению к бета актину эндокардиальные эндотелиальные клетки выразили более высокие уровни маркеров эндокарда Npr3, Hapln1 и Cdn11 по сравнению с коронарными эндотелиальными клетками. Аналогичным образом, коронарные эндотелиальные клетки выражают более высокие уровни коронарных маркеров Fabp4, Mgll и Cd36 по сравнению с эндоцелеальными клетками эндоцелевых эндотелий эндокелея.
Кроме того, оба типа клеток выразили пан-эндотелиальный клеточный маркер гена Cdh5 с несколько более высокими уровнями, наблюдаемыми в коронарных эндотелиальных клетках. Мы можем еще больше очистить клетки с помощью FACS и антител, характерных для популяций клеток. Например, мы можем использовать anti-Npr3 для сортировки ЭЭЗ и анти-Cd36 для сортировки ЭКГ.
Этот метод проложил путь для исследователей, чтобы изучить роль ЕЭК и CECs в развитии сердца и болезней в клеточном типе конкретных образом.
