여기서, 우리는 사람들이 세포 모형 특정 유전자 발현 및 기능을 이해하는 것을 돕기 위하여 심근 세포 및 관상 동맥 내피 세포를 심혼에서 별도로 격리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 고립 된 EEC 및 CEC의 높은 순도 및 생존력과 세포가 격리 시 생리적 특성을 유지한다는 것입니다. CEC와 EEC는 많은 양상에서 다르므로 이러한 세포 집단을 독립적으로 조사하는 능력은 다양한 심장 질환에서 세포 유형 별 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.
이 방법은 세포 모형 특정 방식으로 수많은 심장 질병을 책임지는 전사성 및 후성 유전학 요인의 연구를 촉진할 수 있었습니다. 이 방법의 가장 까다로운 부분은 세포 유형 오염을 피하기 위해 다른 심장 부분을 결정하고 소화타이밍을 올바르게 타이밍을 조정하는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 과학자 인 Yifei Miao가 될 것입니다.
650에서 100 그램 Sprague Dawley 쥐에서 심장을 수확 한 후, 여분의 혈액을 제거하고 해부 현미경 아래에 하나의 심장을 배치하기 위해 차가운 HBSS의 50 밀리리터로 장기를 세 번 세척합니다. 심장을 평평한 후방 얼굴에 배치하여 조직의 왼쪽과 오른쪽면을 식별하고 폐 동맥을 찾습니다. 가위를 사용하여 폐 동맥을 오른쪽 심실 챔버로 자르고 정점에 도달 할 때까지 중격을 따라 자른다.
폐 동맥과 오른쪽 심실 챔버의 접합이 도달 할 때까지 중격을 따라 심장의 후방 측까지 정점에서 절단을 계속합니다. 이 시점부터 심장의 전방 및 후방 측면을 이전 해부 지점에 수직으로 자르고 중격에서 떨어져 오른쪽 심실 자유 벽이 심장의 나머지 부분에서 해방될 때까지 잘라냅니다. 그런 다음 오른쪽 심실 프리 월을 DMEM의 5 밀리리터 튜브에 넣고 대동맥을 다시 찾아 서 방금 입증된 것과 동일한 방식으로 왼쪽 심실 프리 월의 수집을 용이하게합니다.
심실 이없는 벽이 모두 수집되면 조직 샘플을 60센티미터 문화 요리로 옮기고 내부 표면이 접시에 엎드린 채로 놓습니다. 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 조직의 내부 표면만 침지 될 때까지 조직 조각 바로 아래 접시에 0.5 ~ 1 밀리리터의 소화 버퍼를 넣습니다. 원치 않는 세포 오염을 피하기 위해 심실의 내부 표면만 소화 버퍼에 침지되어 정확히 5 분 동안 소화되는 것이 중요합니다.
세포 배양인배기에서 5분 후, 내피세포 배지의 5배의 부피로 소화를 중단한다. 그런 다음 1밀리리터 파이펫을 사용하여 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 유출을 얼음 위에 50 밀리리터 수집 튜브로 옮기는 신선한 매체로 각 심실의 내부 표면을 플러시합니다. 관상 동맥 내피 세포 소화의 경우, 내부 층에서 오염없이 왼쪽 심실의 외부 표면을 따라 잘라 소화 버퍼 1 밀리리터를 포함하는 별도의 5 밀리리터 튜브에 각 튜브 조각을 배치합니다.
EEC의 오염을 방지하려면 심실의 외부 표면에서만 절단하는 것이 중요합니다. 해부 가위를 사용하여 심실 벽을 작은 1 입방 밀리미터 조각으로 다진 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 2~3분마다 소용돌이를 가꾸어 15~20분 동안 튜브를 배치합니다. 다진 조각이 작지만 눈에 띄는 경우 내피 세포 배지 4 밀리리터를 튜브에 추가하고 5 밀리리터 세로지피펫을 사용하여 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 용액 의 전체 볼륨을 얼음의 50 밀리리터 수집 튜브로 전송합니다.
소화 후 CD31 양성 세포 집단을 분리하려면 세포를 원심분리에 의해 펠릿을 흡입하고 슈퍼나티를 흡인시합니다. 어떤 펠릿이 적색인 경우에, 37섭씨 수조에 있는 5 분 잠복에 대한 관 당 적혈구 용해 완충제의 1- 2 밀리리터에 있는 세포를 재중단합니다. 인큐베이션의 끝에서, PBS의 10 밀리리터와 용액을 중지하고 두 번째 원심 분리와 세포를 수집.
다음으로, 선별 완충제 90 마이크로리터와 각 세포 튜브에 항 CD31 PE 항체10 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이 후, 4섭씨에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 철저한 혼합과 튜브에 정렬 버퍼의 10 밀리리터를 추가하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
튜브 당 정렬 버퍼의 80 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단, 안티 PE 마이크로 비드의 20 마이크로 리터의 추가 다음. 소용돌이 후, 튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 놓고, 10밀리리터의 선별 완충제에서 단지 입증된 대로 세척합니다. 얼음에 버퍼를 분류하는 500 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 슈퍼 파라자성 구가 들어 있는 컬럼을 자기 분리기로 놓습니다.
정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 헹구는 다. 컬럼이 비워지면 내막 내피 세포 서스펜션 500마이크로리터를 컬럼에 넣고 세척당 3밀리리터의 정렬 버퍼로 4개의 세척을 넣습니다. 마지막 세척 후, 새로운 15 밀리리터 수집 튜브로 컬럼을 전송하고 수집 튜브로 CD31 양성 세포를 플러시하기 위해 신선한 내피 세포 매체의 컬럼 플런서와 5 밀리리터를 사용합니다.
그런 다음 원심분리에 의해 비드 분리된 내피 세포를 수집한다. 예측된 바와 같이, 정량적 PCR은 관상 동맥 내피 세포에 비해 내막 마커 Npr3, Hapln1 및 Cdn11의 높은 수준을 발현하는 베타 액틴, 내피 성 내피 세포에 비해 있음을 밝힙니다. 마찬가지로, 관상 동맥 내피 세포는 내피 내피 세포에 비해 관상 동맥 마커 Fabp4, Mgll 및 Cd36의 상부를 발현하였다.
추가적으로, 세포의 두 모형은 관상 동맥 내피 세포에서 관찰된 약간 더 높은 수준으로 범내피 세포 마커 유전자 Cdh5를 발현했습니다. 우리는 세포 집단에 특정한 FACS 및 항체를 사용하여 세포를 더 정화할 수 있습니다. 예를 들어 Npr3 반대를 사용하여 EEC 및 안티 Cd36을 정렬하여 CE를 정렬할 수 있습니다.
이 기술은 연구원이 세포 모형 특정 방식으로 심장 발달 및 질병에 있는 EEC와 CECs의 역할을 탐구하는 도로를 포장했습니다.
