هنا، نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا بطانة القلب والخلايا البطانية التاجية بشكل منفصل عن القلب لمساعدة الناس على فهم التعبير الجيني النوع الخلية محددة وظيفة. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي نقاء عالية وديمية البقاء من الجماعة الاقتصادية الأوروبية المعزولة وCEC وأن الخلايا الحفاظ على خصائصها الفسيولوجية عند العزل. وتختلف مراكز CECs و EECs في العديد من الجوانب، وبالتالي فإن القدرة على التحقيق بشكل مستقل في مجموعات الخلايا هذه تمكن من استكشاف آليات نوع الخلية في مختلف أمراض القلب.
يمكن لهذه الطريقة تسهيل دراسة العوامل المستنسخة و اللاجينية المسؤولة عن العديد من أمراض القلب بطريقة محددة نوع الخلية. أصعب أجزاء من هذه الطريقة هي تحديد أجزاء القلب المختلفة وتوقيت الهضم بشكل صحيح لتجنب تلوث نوع الخلية. إثبات الإجراء سيكون (ييفي مياو) عالم أبحاث من مختبري
بعد حصاد القلوب من ستة 50 إلى 100 غرام الجرذان Doley Sprague، وغسل الأعضاء مع 50 ملليلتر من HBSS الباردة ثلاث مرات لإزالة أي الدم الزائد ووضع قلب واحد تحت مجهر تشريح. ضع القلب على وجهه الخلفي المتملق لتحديد الجانبين الأيسر والأيني من الأنسجة وتحديد موقع الشريان الرئوي. استخدم المقص لقطع الشريان الرئوي إلى غرفة البطين الأيمن وقطع على طول الحاجز حتى يتم الوصول إلى القمة.
استمر في القطع من القمة حتى الجانب الخلفي من القلب على طول الحاجز حتى يتم الوصول إلى تقاطع الشريان الرئوي وغرفة البطين الأيمن. بدءا من هذه النقطة، وقطع كلا من الجانبين الأمامي والخلفي للقلب عموديا على نقطة التشريح السابقة وبعيدا عن الحاجز حتى يتم تحرير الجدار الأيمن خالية البطين من بقية القلب. ثم ضع الجدار الأيمن حر البطين في أنبوب خمسة ملليلتر من DMEM وتحديد موقع الشريان الأبهر مرة أخرى لتسهيل جمع الجدار الحر البطين الأيسر بنفس الطريقة كما أظهرت للتو.
عندما تم جمع جميع الجدران الحرة البطينية، نقل عينات الأنسجة إلى طبق ثقافة 60 سنتيمترا مع أسطحها الداخلية ملقاة على وجهه إلى أسفل في الطبق. باستخدام طرف ماصة ملليلتر واحد، إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من عازلة الهضم إلى الطبق مباشرة تحت قطع الأنسجة حتى يتم غمر فقط الأسطح الداخلية للأنسجة. لتجنب تلوث الخلايا غير المرغوب فيه، من المهم أن يكون السطح الداخلي للبطين فقط مغمورًا في عازلة الهضم ويتم هضمه لمدة خمس دقائق بالضبط.
بعد خمس دقائق في الحاضنة ثقافة الخلية، ووقف الهضم مع خمسة أضعاف حجم الخلايا البطانية المتوسطة. ثم استخدم ماصة ملليلتر واحدة لطرد السطح الداخلي لكل بطين مع وسط جديد ينقل الجريان السطحي من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 ملليلتر على الجليد. بالنسبة لعملية هضم الخلايا البطانية التاجية، قطع على طول السطح الخارجي للبطين الأيسر دون تلوث من الطبقة الداخلية ووضع كل جزء أنبوبي في أنبوب منفصل خمسة ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من عازلة الهضم.
لتجنب التلوث من EECs، من المهم قطع فقط من السطح الخارجي للبطين. باستخدام مقص التشريح، ينمّر جدار البطين إلى قطع صغيرة من ملليمتر مكعب واحد ووضع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة مع دوامة كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق. عندما تكون القطع المفرومة صغيرة ولكنها مرئية ، أضف أربعة ملليلترات من متوسطة الخلية البطانية إلى الأنبوب واستخدم ماصة مصلية من خمسة ملليلتر لنقل الحجم الكامل للحل من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 ملليلتر على الجليد.
لعزل مجموعات الخلايا الإيجابية CD31 بعد هضمها، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وpirateate المابير. إذا كانت أي من الكريات حمراء ، فإن إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد إلى ملليلتر من عازل خلايا الدم الحمراء في الأنبوب الواحد لاحتضان لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، أوقف التحلل مع 10 ملليلتر من PBS وجمع الخلايا مع الطرد المركزي الثاني.
بعد ذلك، أضف 90 ميكرولترات من مخزن الفرز المؤقت و10 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة CD31 PE لكل أنبوب من الخلايا. بعد دوامة، احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة 10 ملليلتر من التخزين المؤقت الفرز إلى الأنابيب مع خلط شامل وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend الكريات في 80 ميكرولترات من الفرز العازلة لكل أنبوب، تليها إضافة 20 ميكرولترات من الميكروبات المضادة لPE. بعد دوامة، ووضع الأنابيب في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها الغسيل في 10 ملليلتر من التخزين المؤقت الفرز عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح للتو. Resuspend الكريات في 500 ميكرولترات من التخزين المؤقت الفرز على الجليد ووضع عمود يحتوي على المجالات بارامغناطيسية فائقة في فاصل المغناطيسي.
شطف العمود مع ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للفرز. عندما يتم إفراغ العمود، أضف 500 ميكرولترات من تعليق الخلية البطانية إلى العمود، تليها أربعة يغسل مع ثلاثة ملليلترات من مخزن الفرز لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، نقل العمود إلى أنبوب جمع 15 ملليلتر جديدة واستخدام المكبس العمود وخمسة ملليلتر من وسط الخلايا البطانية الطازجة لطرد الخلايا الإيجابية CD31 من العمود في أنبوب جمع.
ثم جمع الخرزة الخلايا البطانية المعزولة عن طريق الطرد المركزي. كما هو متوقع، يكشف PCR الكمي أن نسبة إلى بيتا أكتين، والخلايا البطانية بطانة القلب أعرب عن مستويات أعلى من علامات بطانة القلب Npr3، Hapln1، وDn11 مقارنة بالخلايا البطانية التاجية. وبالمثل، أعربت الخلايا البطانية التاجية مستويات أعلى من علامات التاجية Fabp4، Mgll، وCD36 مقارنة بالخلايا البطانية.
بالإضافة إلى ذلك، عبّر كلا النوعين من الخلايا عن جين سيه 5 للخلايا ذات الانسانية مع مستويات أعلى قليلاً لوحظت في الخلايا البطانية التاجية. يمكننا تنقية الخلايا باستخدام FACS والأجسام المضادة الخاصة بسكان الخلايا. على سبيل المثال، يمكننا استخدام Anti-Npr3 لفرز EECs و Anti-Cd36 لفرز CECs.
وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف دور الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC في تنمية القلب والمرض بطريقة محددة لنوع الخلية.
