Aquí, presentamos un protocolo detallado para aislar las células endocardiales y las células endoteliales coronarias por separado del corazón para ayudar a las personas a entender la expresión y función génica específica del tipo celular. Las principales ventajas de este método son la alta pureza y viabilidad de la CEE aislada y los CEC y que las células mantienen sus propiedades fisiológicas tras el aislamiento. Los CEC y los CEC difieren en muchos aspectos, por lo que la capacidad de investigar independientemente estas poblaciones celulares permite la exploración de mecanismos específicos del tipo de células en diversas enfermedades cardíacas.
Este método podría facilitar el estudio de factores transcriptonómicos y epigenéticos responsables de numerosas enfermedades cardíacas de una manera específica del tipo celular. Las partes más difíciles de este método son determinar las diferentes porciones del corazón y cronometrar la digestión correctamente para evitar la contaminación del tipo celular. Demostrando el procedimiento estará Yifei Miao, un científico de investigación de mi laboratorio.
Después de cosechar corazones de seis ratas Sprague Dawley de 50 a 100 gramos, lave los órganos con 50 mililitros de HBSS frío tres veces para eliminar cualquier exceso de sangre y coloque un corazón bajo un microscopio de disección. Coloque el corazón en su cara posterior más plana para identificar los lados izquierdo y derecho del tejido y localizar la arteria pulmonar. Use tijeras para cortar a través de la arteria pulmonar hasta la cámara ventricular derecha y cortar a lo largo del tabique hasta que se alcance el ápice.
Continúe cortando desde el ápice hasta el lado posterior del corazón a lo largo del tabique hasta que se alcance la unión de la arteria pulmonar y la cámara ventricular derecha. A partir de este punto, corte los lados anterior y posterior del corazón perpendicularmente al punto de disección anterior y lejos del tabique hasta que la pared libre ventricular derecha se libere del resto del corazón. A continuación, coloque la pared libre ventricular derecha en un tubo de cinco mililitros de DMEM y localice la aorta de nuevo para facilitar la recolección de la pared libre ventricular izquierda de la misma manera que acaba de demostrar.
Cuando se hayan recogido todas las paredes libres de ventriculares, transfiera las muestras de tejido a un plato de cultivo de 60 centímetros con sus superficies internas tumbadas boca abajo en el plato. Con una punta de pipeta de un mililitro, agregue 0,5 a un mililitro de tampón de digestión al plato directamente debajo de las piezas de tejido hasta que solo se sumerjan las superficies internas de los tejidos. Para evitar la contaminación celular no deseada, es importante que solo la superficie interna del ventrículo se sumerja en el tampón de digestión y se digiere durante exactamente cinco minutos.
Después de cinco minutos en la incubadora de cultivo celular, detenga la digestión con cinco veces el volumen de medio celular endotelial. A continuación, utilice una pipeta de un mililitro para lavar la superficie interna de cada ventrículo con un medio fresco que transfiera la escorrentía a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo de recogida de 50 mililitros sobre hielo. Para la digestión de células endoteliales coronarias, corte a lo largo de la superficie externa del ventrículo izquierdo sin contaminación de la capa interna y coloque cada fragmento de tubo en un tubo separado de cinco mililitros que contenga un mililitro de tampón de digestión.
Para evitar la contaminación por EECs, es importante cortar sólo desde la superficie externa del ventrículo. Usando tijeras de disección, picar la pared ventricular en pequeñas piezas de un milímetro cúbico y colocar los tubos en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 15 a 20 minutos con vórtice cada dos a tres minutos. Cuando las piezas picadas sean pequeñas pero visibles, agregue cuatro mililitros de medio de célula endotelial al tubo y utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para transferir todo el volumen de solución a través de un colador de 40 micrómetros en un tubo de recolección de 50 mililitros sobre hielo.
Para aislar las poblaciones de células positivas CD31 después de su digestión, pele el líquido de las células por centrifugación y aspirar los sobrenadantes. Si los gránulos son rojos, resuspender las células en uno a dos mililitros de tólisis de glóbulos rojos tampón por tubo para una incubación de cinco minutos en un baño de agua celsius de 37 grados. Al final de la incubación, detener la lelisis con 10 mililitros de PBS y recoger las células con una segunda centrifugación.
A continuación, agregue 90 microlitros de tampón de clasificación y 10 microlitros de anticuerpos anti-CD31 PE a cada tubo de células. Después del vórtice, incubar las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, añadir 10 mililitros de tampón de clasificación a los tubos con mezcla completa y recoger las células por centrifugación.
Resuspender los pellets en 80 microlitros de tampón de clasificación por tubo, seguido de la adición de 20 microlitros de microperas anti-PE. Después del vórtice, coloque los tubos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, seguidos de lavado en 10 mililitros de tampón de clasificación por centrifugación como se acaba de demostrar. Resuspender los pellets en 500 microlitros de tampón de clasificación sobre hielo y colocar una columna que contenga esferas superparamagnéticas en un separador magnético.
Enjuague la columna con tres mililitros de tampón de clasificación. Cuando la columna se haya vaciado, agregue 500 microlitros de la suspensión de celda endotelial endocardial a la columna, seguido de cuatro lavados con tres mililitros de tampón de clasificación por lavado. Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 15 mililitros y utilice el émbolo de columna y cinco mililitros de medio de celda endotelial fresco para vaciar las células positivas CD31 de la columna en el tubo de recolección.
Luego recoja las células endoteliales aisladas del cordón por centrifugación. Como se predijo, la PCR cuantitativa revela que, en relación con la beta actina, las células endoteliales endocardiales expresaron niveles más altos de los marcadores endocardiales Npr3, Hapln1 y Cdn11 en comparación con las células endoteliales coronarias. Del mismo modo, las células endoteliales coronarias expresaron niveles más altos de los marcadores coronarios Fabp4, Mgll y Cd36 en comparación con las células endoteliales endocardiales.
Además, ambos tipos de células expresaron el gen marcador de células pan-endoteliales Cdh5 con niveles ligeramente más altos observados en las células endoteliales coronarias. Podemos purificar aún más las células usando FACS y anticuerpos específicos para las poblaciones celulares. Por ejemplo, podemos usar anti-Npr3 para ordenar los EEC y los anti-Cd36 para ordenar los CEC.
Esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran el papel de la CEE y los CEC en el desarrollo cardíaco y la enfermedad de una manera específica del tipo de célula.
