Burada, endokardiyal hücre ve koroner endotel hücrelerinin kalpten ayrı olarak izole edilebilmek için ayrıntılı bir protokol sunarak insanların hücre tipine özgü gen ekspresyonu ve işlevini anlamalarına yardımcı oluyoruz. Bu yöntemin başlıca avantajları, izole edilmiş AET ve CeC'lerin yüksek saflık ve canlılığı dır ve hücrelerin izole edilip fizyolojik özelliklerini korumalarıdır. MSK'lar ve EEC'ler birçok açıdan farklılık gösterirler, bu nedenle bu hücre popülasyonlarını bağımsız olarak araştırma yeteneği çeşitli kalp hastalıklarında hücre tipine özgü mekanizmaların araştırılmasını sağlar.
Bu yöntem, hücre tipine özgü bir şekilde çok sayıda kalp hastalığından sorumlu transkriptomik ve epigenetik faktörlerin incelenmesini kolaylaştırabilir. Bu yöntemin en zor kısımları farklı kalp kısımları belirlenmesi ve doğru hücre tipi kontaminasyonu önlemek için sindirim zamanlama vardır. Prosedürü gösteren Yifei Miao, benim laboratuarımdan bir araştırma bilim adamı olacak.
Altı 50 ila 100 gram Sprague Dawley sıçan kalpleri hasat sonra, herhangi bir fazla kan kaldırmak ve bir kalp diseksiyon mikroskop altında yerleştirmek için soğuk HBSS beş0 mililitre ile üç kez organları yıkayın. Dokuyun sol ve sağ taraflarını belirlemek ve pulmoner arteri bulmak için kalbi düz posterior yüzüne yerleştirin. Sağ ventrikül odasına pulmoner arter ile kesmek için makas kullanın ve apeks ulaşıncaya kadar septum boyunca kesti.
Pulmoner arter ve sağ ventrikül odası nın kavşak ulaşınına kadar septum boyunca kalbin arka tarafında apeks kadar kesme ye devam edin. Bu noktadan başlayarak, kalbin ön ve arka taraflarını bir önceki diseksiyon noktasına dik olarak ve sağ ventrikül serbest duvarı kalbin geri kalanından kurtarılana kadar septumdan uzaklaştırın. Daha sonra sağ ventrikülserbest duvarDMEM beş mililitrelik tüp içine yerleştirin ve sadece gösterildiği gibi aynı şekilde sol ventrikül serbest duvar toplama kolaylaştırmak için tekrar aort bulmak.
Tüm ventriküler serbest duvarlar toplandığında, doku örneklerini iç yüzeyleri çanakta yüzüstü yatan 60 santimetrelik bir kültür yemeğine aktarın. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, dokuların sadece iç yüzeyleri batırılır kadar doğrudan doku parçaları altında çanak sindirim tampon 0,5 ila bir mililitre ekleyin. İstenmeyen hücre kontaminasyonunu önlemek için, ventrikülün sadece iç yüzeyinin sindirim tamponuna daldırılması ve tam olarak beş dakika boyunca sindirilmiş olması önemlidir.
Hücre kültürü kuluçka beş dakika sonra, endotel hücre orta hacmi beş kat hacmi ile sindirim durdurmak. Daha sonra her ventriküliç yüzeyini temiz bir ortamla yıkamak için bir mililitrelik pipet kullanın ve akıntıyı 40 mikrometrelik bir süzgeçten buz üzerinde 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarın. Koroner endotel hücre sindirimi için, iç tabakadan kontaminasyon olmadan sol ventrikül dış yüzeyi boyunca kesilmiş ve sindirim tampon bir mililitre içeren ayrı bir beş mililitretüp her tüp yerleştirin.
EBM'lerden kaynaklanan kirlenmeyi önlemek için, sadece ventrikülün dış yüzeyinden kesilmek önemlidir. Diseksiyon makası kullanarak, küçük bir milimetrelik parçalar halinde ventriküler duvar kıyma ve her iki ila üç dakikada bir girdap ile 15-20 dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosu tüpler yerleştirin. Kıyılmış parçalar küçük ama görünür olduğunda, tüpe dört mililitre endotel hücreli ortam ekleyin ve çözeltinin tüm hacmini 40 mikrometrelik bir süzgeçten buz üzerinde 50 mililitrelik toplama tüpüne aktarmak için beş mililitrelik serolojik pipet kullanın.
CD31 pozitif hücre popülasyonlarını sindirimden sonra izole etmek için, hücreleri santrifüj ile peletleyin ve süpernatantları aspire edin. Herhangi bir pelet kırmızı ise, 37 derece santigrat su banyosunda beş dakikalık bir kuluçka için tüp başına kırmızı kan hücresi lisis tampon bir ila iki mililitre hücreleri yeniden askıya. Kuluçka sonunda, 10 mililitre PBS ile lysis durdurmak ve ikinci bir santrifüj ile hücreleri toplamak.
Daha sonra, hücrelerin her tüpüne 90 mikrolitre sıralama tamponu ve 10 mikrolitre anti-CD31 PE antikor ekleyin. Girdap tan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, iyice karıştırma ile tüplere sıralama tampon 10 mililitre ekleyin ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
Tüp başına tampon sıralama 80 mikrolitre pelet resuspend, anti-PE mikroboncuklar 20 mikrolitre eklenmesi takip. Girdap sonra, 15 dakika boyunca dört derece santigrat tüpler yerleştirin, sadece gösterildiği gibi santrifüj tarafından sıralama tampon 10 mililitre yıkama takip. 500 mikrolitrelik sıralama tamponundaki peletleri buz üzerinde yeniden askıya alın ve süper paramanyetik küreler içeren bir sütunu manyetik ayırıcıya yerleştirin.
Sütunu üç mililitre sıralama arabelleğiyle durulayın. Sütun boşaltıldığında, kolona endokardiyal endotelyal hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini ekleyin ve ardından yıkama başına üç mililitre sıralama tamponu ile dört yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, sütunu yeni bir 15 mililitrelik toplama tüpüne aktarın ve CD31 pozitif hücreleri kolonun dışına, toplama tüpüne atmak için sütun pistonlu ve beş mililitre taze endotel hücreli orta kullanın.
Sonra santrifüj ile boncuk izole endotel hücreleri toplamak. Tahmin edildiği gibi, kantitatif PCR beta aktin göreli olduğunu ortaya koymaktadır, endokardiyal endotel hücreleri endokardiyal belirteçleri Npr3, Hapln1 daha yüksek düzeyde ifade, Ve Cdn1 koroner endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında. Aynı şekilde, koroner endotel hücreleri endokardiyal endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında koroner belirteçleri Fabp4, Mgll ve Cd36 daha yüksek düzeyde ifade.
Ayrıca, her iki hücre tipi de koroner endotel hücrelerinde gözlenen biraz daha yüksek düzeyde pan-endotel hücre marker geni Cdh5 ifade. Hücreleri FACS ve hücre popülasyonlarına özgü antikorlar kullanarak daha da arındırabiliriz. Örneğin, EEC'leri sıralamak için Anti-Npr3'u ve MDC'leri sıralamak için anti-Cd36'yı kullanabiliriz.
Bu teknik, araştırmacıların AET ve Mm'lerin kalp gelişimi ve hastalıktaki rolünü hücre tipine özgü bir şekilde keşfetmelerinin yolunu açmıştır.
