Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para isolar células endocárdicas e células endoteliais coronárias separadamente do coração para ajudar as pessoas a entender a expressão e função genética específica do tipo celular. As principais vantagens deste método são a alta pureza e viabilidade dos CECs isolados e que as células mantêm suas propriedades fisiológicas no isolamento. Os CECs e os CEOs diferem em muitos aspectos, de modo que a capacidade de investigar independentemente essas populações celulares permite a exploração de mecanismos específicos do tipo celular em várias doenças cardíacas.
Esse método poderia facilitar o estudo de fatores transcritos e epigenéticos responsáveis por inúmeras doenças cardíacas de forma específica do tipo celular. As partes mais complicadas deste método são determinar as diferentes porções cardíacas e cronometrar a digestão corretamente para evitar a contaminação do tipo celular. Demonstrando o procedimento será Yifei Miao, um cientista de pesquisa do meu laboratório.
Depois de colher corações de seis ratos Sprague Dawley de 50 a 100 gramas, lave os órgãos com 50 mililitros de HBSS frio três vezes para remover qualquer excesso de sangue e colocar um coração sob um microscópio dissecando. Posicione o coração em seu rosto posterior liso para identificar os lados esquerdo e direito do tecido e localizar a artéria pulmonar. Use uma tesoura para cortar a artéria pulmonar até a câmara ventricular direita e corte ao longo do septo até que o ápice seja alcançado.
Continue cortando do ápice até o lado posterior do coração ao longo do septo até que a junção da artéria pulmonar e da câmara ventricular direita seja alcançada. A partir deste ponto, corte os lados anterior e posterior do coração perpendicularmente ao ponto de dissecção anterior e longe do septo até que a parede livre ventricular direita seja liberada do resto do coração. Em seguida, coloque a parede livre ventricular direita em um tubo de cinco mililitros de DMEM e localize a aorta novamente para facilitar a coleta da parede livre ventricular esquerda da mesma maneira que apenas demonstrou.
Quando todas as paredes livres ventriculares tiverem sido coletadas, transfira as amostras de tecido para um prato de cultura de 60 centímetros com suas superfícies internas deitadas de bruços no prato. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro, adicione 0,5 a um mililitro de tampão de digestão ao prato diretamente sob as peças de tecido até que apenas as superfícies internas dos tecidos estejam imersas. Para evitar contaminação celular indesejada, é importante que apenas a superfície interna do ventrículo esteja imersa no tampão de digestão e seja digerida por exatamente cinco minutos.
Após cinco minutos na incubadora de cultura celular, pare a digestão com cinco vezes o volume do meio celular endotelial. Em seguida, use uma pipeta de um mililitro para lavar a superfície interna de cada ventrículo com meio fresco transferindo o escoamento através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 50 mililitros no gelo. Para digestão de células endoteliais coronárias, corte ao longo da superfície externa do ventrículo esquerdo sem contaminação da camada interna e coloque cada fragmento do tubo em um tubo separado de cinco mililitros contendo um mililitro de tampão de digestão.
Para evitar contaminação dos CEE, é importante cortar apenas a superfície externa do ventrículo. Usando uma tesoura de dissecção, pique a parede ventricular em pequenos pedaços de um milímetro cúbico e coloque os tubos em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos com vórtice a cada dois ou três minutos. Quando as peças picadas forem pequenas, mas visíveis, adicione quatro mililitros de meio celular endotelial ao tubo e use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para transferir todo o volume da solução através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 50 mililitros no gelo.
Para isolar as populações celulares positivas CD31 após sua digestão, pelota as células por centrifugação e aspirar os supernantes. Se alguma pelota estiver vermelha, resuspense as células em um a dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por tubo para uma incubação de cinco minutos em um banho de água de 37 graus Celsius. No final da incubação, pare a lise com 10 mililitros de PBS e colete as células com uma segunda centrifugação.
Em seguida, adicione 90 microliters de tampão de classificação e 10 microliters de anticorpo anti-CD31 PE a cada tubo de células. Após o vórtice, incubar as células por 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione 10 mililitros de tampão de classificação aos tubos com mistura completa e colete as células por centrifugação.
Resuspend as pelotas em 80 microliters de tampão de classificação por tubo, seguido pela adição de 20 micro-escrivães de microesferas anti-PE. Após o vórtice, coloque os tubos a quatro graus Celsius por 15 minutos, seguido de lavagem em 10 mililitros de tampão de classificação por centrifugação como apenas demonstrado. Resuspenque as pelotas em 500 microliters de tampão de classificação no gelo e coloque uma coluna contendo esferas super paramagnéticas em um separador magnético.
Enxágüe a coluna com três mililitros de tampão de classificação. Quando a coluna tiver esvaziado, adicione 500 microliters da suspensão da célula endotelial endocardial à coluna, seguida por quatro lavagens com três mililitros de tampão de classificação por lavagem. Após a última lavagem, transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 15 mililitros e use o êmbolo da coluna e cinco mililitros de meio celular endotelial fresco para lavar as células positivas CD31 da coluna para o tubo de coleta.
Em seguida, colete as células endoteliais isoladas por centrifugação. Como previsto, o PCR quantitativo revela que em relação à beta actina, as células endoteliais do endocárdio expressaram níveis mais elevados dos marcadores endocárdias Npr3, Hapln1 e Cdn11 em comparação com as células endoteliais coronárias. Da mesma forma, as células endoteliais coronárias expressaram níveis mais elevados dos marcadores coronários Fabp4, Mgll e Cd36 em comparação com as células endoteliais endocárdias.
Além disso, ambos os tipos de células expressaram o gene marcador de células pan-endotelial Cdh5 com níveis ligeiramente mais elevados observados em células endoteliais coronárias. Podemos purificar ainda mais as células usando FACS e anticorpos específicos para as populações celulares. Por exemplo, podemos usar o anti-Npr3 para classificar EECs e anti-Cd36 para classificar CECs.
Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem o papel dos CEE e CECs no desenvolvimento cardíaco e na doença de forma específica do tipo celular.
