Методы количественной оценки различных частиц представляют собой критический аспект большинства биологических исследований. Этот протокол позволяет точно количественно оценивать вирусные данные в режиме реального времени. Этот метод заменяет традиционное измерение вирусных данных.
Благодаря объективным данным в реальном времени мы находимся ниже нашего доверительного интервала, избегая оценки трудоемких конечных точек. Этот метод может быть использован для всех вирусов, которые вызывают цитопатический эффект. Демонстрировать процедуру будет Квентин Грассин, лаборант из нашей лаборатории.
Для размножения и амплификации вирусов H1N1 засейте 7,5 раз 10 до 6 клеток MDCK на двух колбах для культивирования тканей площадью 75 квадратных сантиметров в соответствии со стандартными протоколами и инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия, чтобы достичь 90-100% слияния. На следующий день промыть клетки два раза пятью миллилитрами стерильного PBS на колбу за стирку и пометить одну колбу в качестве контрольной. Затем разбавляют размороженный флакон с запасом вируса гриппа А до соответствующей экспериментальной концентрации в 1,5-миллилитровой пробирке, содержащей свежую среду распространения вируса.
Используйте один миллилитр разбавленного вещества для заражения клеток MDCK при множественности инфекции от 1 раза 10 до отрицательных 3 или 1 раз 10 до отрицательных 4 бляшек на клетку и добавьте один миллилитр среды распространения вируса в контрольную колбу. Адсорбировать вирус к клеткам в течение 45 минут при комнатной температуре, помешивая каждые 15 минут. В конце инкубации удаляют инокулятор и заменяют его 15 миллилитрами среды размножения вируса, дополненной одним микрограммом на миллилитр трипсина TPCK для облегчения расщепления вирусного гемагглютинина HA0 на субъединицы HA1 и HA2.
Затем поместите колбу в инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия на три дня. В конце инкубации сравните клетки в каждой культуре под 40-кратным объективом на световом микроскопе, чтобы оценить цитопатические эффекты на клетки. Когда цитопатический эффект будет завершен, добавьте супернатанты клеточной культуры в 15-миллиметровую трубку и соберите клеточный мусор с каждой культуры путем центрифугирования.
Затем переложите осветленный супернатант культуры вируса в 15-миллилитровую трубку, а вирусы потомства переложите на одноразовые стерильные криогенные флаконы для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы определить соответствующее количество клеток для клеточной инфекции, подготовьте 24-часовое примерно 80% сливающихся клеточных культур MDCK, как показано перед промывкой клеток PBS и сбором их с 45-минутной инкубацией в трех миллилитрах 0,25% трипсина-ЭДТА на колбу при 37 градусах Цельсия. Когда клетки отделятся, остановите реакцию семью миллилитрами свежей питательной среды на колбу и посчитайте клетки из каждой культуры.
Разбавляют клетки до 4 раз по 10 до 5 клеток на миллилитр клеточной культуральной среды и выполняют двукратное последовательное разведение клеток по показаниям. Поместите Е-пластину при комнатной температуре на несколько минут, прежде чем добавлять 100 микролитров клеточной культуральной среды в каждую лунку, не касаясь электродов Е-пластины. Разблокируйте люльки и вставьте передний конец пластины в карман колыбели прибора для измерения импеданса.
Закройте дверцу инкубатора и откройте программное обеспечение. В настройках шаблона эксперимента по умолчанию выделите выбранные подставки и дважды щелкните верхнюю страницу, чтобы ввести имя эксперимента. Нажмите Макет и введите необходимую информацию об образце для каждого выбранного колодца пластины.
Щелкните Расписание, шаги и Добавить шаг. Программное обеспечение автоматически добавит один секундный шаг для измерения фонового импеданса Нажмите Выполнить и Начать, Продолжить. Нажмите кнопку «График и добавить», чтобы выбрать подходящие скважины, подтвердив, что фоновое сопротивление находится между отрицательными 0,1 и 0,1, прежде чем перейти к следующему шагу.
Далее снимите пластину с люльки и добавьте 100 микролитров каждой клеточной суспензии в соответствующие колодцы в двух экземплярах. Оставьте Е-пластину в ламинарной проточной вытяжке на 30 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по дну колодцев перед загрузкой Е-пластины в карман колыбели. Щелкните Расписание и Добавить шаг и введите значения для наблюдения за ячейками каждые 30 минут в течение 200 повторений, прежде чем выбрать Начать, Продолжить.
Чтобы проверить и построить график данных об импедансе клеток, нажмите «График» и выберите концентрацию клеток, которая находится непосредственно перед стационарной фазой через 24 часа после посева, чтобы получить клетки, которые все еще находятся в фазе роста во время вирусной инфекции. Чтобы определить корреляцию между значениями CIT50 и множественностью инфекции, после культивирования 3-кратно 10 до 4-й свежерасщепленных клеток MDCK в каждую лунку электронной микротитровой пластины в течение 24 часов промыть клетки два раза 100 микролитрами свежей среды распространения вируса на скважину, на промывку, и использовать одноканальную пипетку для добавления 100 микролитров вирусной суспензии в каждую лунку. Когда все разбавления вируса будут добавлены, осторожно загрузите пластину в карман колыбели инструмента при 35 градусах Цельсия и начните мониторинг импеданса клеток каждые 15 минут в течение не менее 100 часов, как показано.
После двух циклов измерений нажмите, чтобы приостановить аппарат, и снимите Е-пластину с люльки. Добавьте в каждую лунку 100 микролитров среды для размножения вируса, дополненной трипсином TPCK, и верните Е-пластину в карман колыбели. Затем приступайте к анализу.
Для оценки кинетики выживаемости вируса гриппа А добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 35 грамм на литр в дистиллированной воде и добавляют 900 микролитров полученного солевого раствора в двухмиллилитрные криотрубки. Добавьте 100 микролитров вирусного запаса в каждую криотрубку и поместите трубки в инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия на соответствующий экспериментальный период времени. За день до окончания инкубации засевают 3 раза по 10 до 4-го свежерасщепленных клеток MDCK и 100 микролитров среды размножения вируса на лунку в 16-луночную микротитровую пластину в повторных шагах, что позволяет измерить фоновое сопротивление и равномерное распределение клеток на дно лунок.
Затем выращивайте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день промыть клетки дважды, затем заразить клетки 100 микролитрами соленого дистиллированного вируса, разбавленного 10 раз в свежей питательной среде, как показано, и контролировать импеданс клеток каждые 15 минут в течение не менее 100 часов. Здесь показаны исходные данные, полученные через 120 часов с различными концентрациями клеток MDCK.
Через 24 часа измерения клеточного индекса показали, что клетки в колодцах, засеянных 3 раза 10 до 4-х клеток, все еще находились в экспоненциальной фазе роста, поэтому эта концентрация клеток использовалась для последующих экспериментов. Клеточные культуры MDCK демонстрируют четкую линейную зависимость между CIT50 и начальной множественностью инфекции вирусом гриппа. Результаты типичного кинетического эксперимента по выживанию показывают снижение клеточного индекса из-за вирус-индуцированного цитопатическим эффектом.
CIT50 может быть использован для расчета наклона вирусной инактивации для каждого вируса в каждом состоянии для определения того, какой вирус имел наибольшую стабильность в исследуемой среде. Стабильность вируса косвенно коррелирует со склоном инактивации, позволяя, например, идентифицировать аминокислотные остатки в гемагглютининовом гликопротеине, которые участвуют в выживании вируса гриппа А вне хозяина. Эта техника очень чувствительна к небольшим вариациям.
Поэтому рекомендуется использовать автоматический счетчик клеток для получения воспроизводимых результатов между экспериментами. Этот метод также может быть использован для сравнения репликации различных вирусов, для исследования тропизма вируса для нескольких клеточных линий одновременно или для изучения конкретных этапов вирусного цикла.
