Этот протокол позволял непрерывно выявлять транзиторный эффект в виде некоторых морфологических изменений во время вирусной инфекции, таких как отслоение и всплытие адгезивных клеток. Этот протокол позволил использовать неинвазивный и нетрудоемкий подход для непрерывного мониторинга морфологических изменений клеток и регистрации транзиторных эффектов, таких как сосудистая утечка, которая может быть пропущена анализом конечной точки. Этот протокол может быть использован для анализа изменений целостности сосудов других клеточных линий в различных экспериментальных условиях, если клетки являются адгезивными.
После подготовки HUVEC запустите программное приложение RTCA, дважды щелкнув значок на рабочем столе. Введите логин и пароль в окне входа в систему. Поместите пластину резистора RTCA на 96 лунок лункой A1 внутрь в станцию RTCA, расположенную в инкубаторе клеточных культур.
Затем перейдите на вкладку «Заметки об эксперименте» программного обеспечения RTCA и введите название эксперимента, серийный номер устройства и тип устройства. На вкладке «Компоновка» на вкладке «Ячейка» программного обеспечения RTCA выделите все скважины и щелкните правой кнопкой мыши на выделенных лунках, чтобы убедиться, что все скважины включены. Затем откройте вкладку «Расписание» программного обеспечения RTCA.
Нажмите кнопку Step_1 и задайте для параметра Сдвиг значение 10, а для интервала — 30 секунд. Затем нажмите «Продолжить» в левом верхнем углу программного обеспечения, чтобы начать проверку. После выполнения откройте вкладку индекса ячейки, чтобы проверить данные.
Все значения индекса ячейки должны быть меньше 0,063. Затем проверьте необработанные данные сканирования в нижней части вкладки индекса ячейки на наличие повторяющихся шаблонов значений, как описано в рукописи. Чтобы завершить проверочный прогон, щелкните пластину и выберите Освободить пластину.
Снимите пластину резистора RTCA на 96 лунок со станции RTCA. Чтобы получить фоновые показания RTCA, дважды промойте специализированную золотую микроэлектродную пластину с коллагеновым покрытием типа 1 с 60 микролитрами HBSS на лунку. Оставшийся HBSS выбросьте, и добавьте 50 миллилитров на лунку внеклеточного матрикса.
Затем поместите планшет в станцию RTCA, расположенную в инкубаторе клеточных культур, лункой A1 направленной внутрь. На вкладке «Примечания к опыту» программного обеспечения RTCA введите название эксперимента, серийный номер устройства и тип устройства. Перейдите на вкладку ячейки программного обеспечения RTCA и выберите вкладку макета.
Выделите колодцы, которые будут использоваться, и щелкните правой кнопкой мыши по выделенным лункам, чтобы убедиться, что все колодцы включены. Теперь перейдите на вкладку «Расписание» программного обеспечения RTCA. Нажмите Step_1 и нажмите «Начать» или «Продолжить» в левом верхнем углу, чтобы получить фоновое чтение.
Теперь планшет готов к посеву клеток и удалению со станции RTCA. После этого высевают от 10 до четвертой ячеек на лунку HUVEC в золотую микроэлектродную пластину по 50 микролитров на лунку кондиционированной среды. Поместите планшет обратно в станцию RTCA, расположенную в инкубаторе для клеточных культур, так, чтобы отверстие A1 было направлено внутрь.
Затем на вкладке «Расписание» программного обеспечения нажмите «Добавить шаг» в левом верхнем углу. Нажмите на Step_2. Измените свип на 601, интервал на две минуты и нажмите применить.
Нажмите на Step_2 и нажмите «Начать» или «Продолжить» в левом верхнем углу программного обеспечения. После 20 часов инкубации, когда значения индекса клеток на вкладке графика лунок показывают плато, планшет готов к заражению. На вкладке «Расписание» программного обеспечения RTCA нажмите кнопку «Прервать шаг».
Теперь пластина готова к снятию со станции RTCA. Чтобы заразить HUVEC, извлеките запас вируса Зика из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов по Цельсию. Разбавляют запас вируса Зика безсывороточным внеклеточным матриксом в центрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра для достижения кратности инфекции 0,1 и единицы.
Затем выбросьте кондиционированную среду из каждой лунки и промойте каждую лунку 60 микролитрами HBSS, используя боковую часть лунки. Добавьте 40 микролитров разбавленного образца вируса в лунку, начиная с самого высокого к самому низкому разведению, используя сторону лунки. Инкубируйте планшет в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа, чтобы обеспечить поглощение вируса.
Вращайте пластину пять раз каждые 15 минут, чтобы обеспечить поглощение вируса по всему монослою клетки. После одного часа инкубации удалите и выбросьте вирусную суспензию от самой низкой концентрации до самой высокой. Промойте зараженные клетки дважды 60 миллилитрами HBSS.
Наложите лунки на внеклеточный матрикс, дополненный 2%-ным FBS. Для положительных контрольных лунок разбавляют тромбин в дозе 20 единиц на миллилитр внеклеточным матриксом с добавлением 2% FBS и накладывают на лунки тромбинсодержащую внеклеточную матриксную среду, используя боковую сторону лунки. Теперь нажмите на вкладку «Расписание» и добавьте шаг в левом верхнем углу.
Перейдите в раздел Step_3 и измените сдвиг на 3 601, а интервал на две минуты. Нажмите «Применить», затем нажмите «ОК» во всплывающем окне. Поместите инфицированную специализированную золотую микроэлектродную пластину лункой А1 внутрь в станцию RTCA, расположенную в культуральном инкубаторе.
Наконец, нажмите на Step_3 и нажмите «Продолжить» в левом верхнем углу программного обеспечения. Значение клеточного индекса HUVEC, инфицированных вирусом Зика P6-740 при кратности инфекции 0,1, начало снижаться через 15 часов после заражения по сравнению с отрицательным инфекционным контролем. У HUVEC, инфицированных более высокой дозой вируса Зика P6-740 при кратности одного заражения, наблюдалось снижение клеточного индекса через 11 часов после заражения.
Через 24 часа после заражения наблюдалось снижение нормализованного клеточного индекса на 5% и 7% при инфицировании эндотелиальных клеток с кратностью инфекции 0,1 и 1 соответственно. Снижение нормализованного значения клеточного индекса на 50% было зарегистрировано через 96 ч после заражения и через 66,75 ч после заражения при кратности инфекции 0,1 и 1 соответственно. Нормализованное значение клеточного индекса достигло самой низкой точки через 107 часов после заражения, со снижением на 51% и 60% после заражения при кратности инфекции 0,1 и 1 соответственно.
Было обнаружено, что нормализованное значение клеточного индекса увеличилось на 4% и 13% с 107 часов после заражения и до конца эксперимента через 168 часов после заражения. Перед каждым экспериментом RTCA необходимо провести проверку резистора с использованием 96-луночной RTCA-пластины, чтобы убедиться, что каждый биосенсор работает хорошо и дает надежные значения клеточного индекса.
