Используя этот протокол, срезы ткани левого желудочка человека могут культивироваться ex vivo в биомиметической камере. Применение предварительных и постнагрузок улучшает сходство физиологической среды. Этот метод позволяет непрерывно регистрировать сокращение тканей.
Определяемые пользователем протоколы стимуляции позволяют оценивать жизненно важные параметры сокращения, такие как потенцирование после паузы, порог стимуляции, соотношение силы и частоты и рефрактерный период. Долгосрочное культивирование срезов миокарда с использованием этой установки проложит путь для будущих исследований ex vivo, облегчая этот скрининг на терапевтические и кардиотоксические лекарственные эффекты в сердечно-сосудистой медицине. Для начала погружают камеры культивации и графитовые электроды в один литр 10% раствора изопропанола и перемешивают в течение ночи.
На следующий день переведите камеры в 100% раствор изопропанола в течение 3 минут, затем дайте камерам и графитовым электродам высохнуть на воздухе под ламинарной проточной вытяжкой. Прикрепите печатную плату к каждой камере в соответствии с доступными положениями на коромысле. Поместите два графитовых электрода на печатную плату в соответствии с инструкциями производителя, затем поместите 35-миллиметровую крышку чашки Петри на камеру, чтобы предотвратить инфекцию.
Затем заполните лоток для резки до 90-95% буфером нарезки. Переложите образец ткани в 100-миллиметровую чашку Петри, наполненную буфером холодной нарезки, и поместите чашку на охлаждающую пластину при 4 градусах Цельсия. Удалите трабекулы эндокарда, удерживая эндокард пинцетом, затем с помощью ножниц отрежьте примерно 3 миллиметра эндокардиальной ткани.
Зафиксируйте образец разрезанной ткани с эндокардиальной стороны до резинового пластыря размером 2 на 2 сантиметра с помощью четырех игл 0,9 на 70 миллиметров 20-миллиметрового калибра, которые фиксируются в квадратном положении. Убедитесь, что диагональный край каждого кончика иглы направлен внутрь, усиливая фиксацию и предотвращая повреждение миокарда. С помощью скальпеля отрежьте всю лишнюю ткань за пределами четырех игольчатых квадратов.
Используя пинцет, поместите обрезанный образец на стерильный кусок ткани на 10 секунд, чтобы удалить лишний буфер нарезки. Далее снимите шприц агарозы с водяной бани и погрузите образец в агарозу. Дайте агарозе затвердеть в течение пяти минут на охлаждающей пластине.
Эндокардиальная сторона образца должна быть видна в агарозе. Используя пинцет, поместите эпикардиальную сторону образца, содержащегося в агарозе, поверх склеенной области, затем осторожно надавите на агарозосодержащий образец сверху тупым инструментом, не разрезая и не повреждая агарозу. Дайте клею затвердеть в течение 1 минуты.
Установите амплитуду вибрации на 1 миллиметр, начальную скорость резания на 0,07 миллиметра в секунду, а толщину среза на 300 мкм. После подключения системы выращивания к компьютеру запустите соответствующую программу. Установите скорость качельки на 60 об/мин и заранее задайте параметры стимуляции.
Для сердечных срезов человека установите стандартную стимуляцию двухфазных импульсов с 50 миллиампер или током, состоящим из 3 миллисекунд положительного тока, 1 миллисекундной паузы и 3-миллисекундного импульса инвертированного тока со скоростью 30 ударов в минуту или уд/мин, затем проверьте электродные индикаторы программного обеспечения и убедитесь, что электроды камер культивирования работают правильно. С помощью пинцета отделяют агарозу от ткани. Избегайте прикосновения к ткани и обращайтесь с ней осторожно, так как любое повреждение ткани снизит вероятность успеха культивирования.
Чтобы прикрепить два пластиковых треугольника к образцу, поместите 1 микролитр клея на стерильную крышку чашки Петри. Используйте крючковатый пинцет, чтобы подобрать один автоклавный пластиковый треугольник. Быстро окуните передний край треугольника в клей и наклейте треугольник на образец перпендикулярно выравниванию кардиомиоцитов.
Повторите для другого треугольника. С помощью скальпеля обрежьте ткань, превышающую ширину треугольника, и поместите срез с двумя установленными треугольниками обратно в лоток для резки, содержащий буфер нарезки. Выньте из инкубатора заполненную средой камеру культивации.
Выберите один подготовленный кусочек и вставьте его в камеру, соединив по одному треугольнику с каждым штифтом. Отрегулируйте расстояние между крепежными штифтами в соответствии с размером выборки. Убедитесь, что образец погружен в среду.
После размещения тарелки на коромысле уменьшите преднагрузку, повернув регулировочный винт против часовой стрелки, пока базовая линия соответствующего графика на экране компьютера больше не изменится, затем осторожно увеличьте преднагрузку или натяжение, повернув регулировочный винт по часовой стрелке. Для камер с высокой жесткостью продолжайте до тех пор, пока соответствующая базовая линия на графике не увеличится на 1 000 до 1 200 единиц, соответствующих одной преднатягу миллиньютона. После приготовления свежей среды для выращивания предварительно разогрейте среду на водяной бане или в инкубаторе горячего воздуха при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-45 минут.
Удалите среду из камеры, оставив примерно 0,8 миллилитра в камере, затем добавьте 1,6 миллилитра свежей среды в ту же камеру, сделав общий объем среды до 2,4 миллилитров на камеру. Наконец, поместите крышку камеры назад и поместите камеру культивации в соответствующее положение. Считывание сокращения пяти срезов миокарда во время типичной стимуляции состояло из четырех отдельных участков потенцирования после паузы, порога стимуляции, соотношения силы и частоты и рефрактерного периода.
По сравнению с контролем, сила сокращения срезов, обработанных антагонистами кальция, нифедипином и кальцисептином, была снижена в течение 10 минут. Напротив, агонист кальциевого канала с напряжением, Bay-K8644, увеличивал силу сжатия. Потенцирование контрольных и обработанных срезов после паузы оценивали на предмет внутриклеточного высвобождения кальция из саркоплазматического ретикулума.
В разделе элемента управления не было обнаружено никаких изменений. В присутствии кальцисептина и нифедипина ингибирование кальциевых каналов L-типа приводило к потенцированию первого сокращения после паузы в 50 секунд, отражая более высокий относительный вклад внутриклеточного высвобождения кальция в общую сократимость. Противоположный эффект наблюдался при применении Bay-K8644, который стимулирует поступление внеклеточного кальция по кальциевым каналам L-типа.
В анализе соотношения сила-частота не наблюдалось никаких изменений в контрольном срезе. Лечение кальцисептином не изменяло способность среза следовать стимулам при увеличении частоты стимуляции при сравнении данных до и после лечения. По сравнению с кальцисептином, нифедипин предотвращал увеличение сократимости при более высоких темпах и снижал максимальную скорость захвата при 80 уд/мин.
При Bay-K8644 наблюдалось увеличение силы сжатия при очень низких частотах стимуляции. Однако на частотах выше 50 ударов в минуту сила сжатия была ниже, чем во время предварительного состояния. Иссеченная ткань должна быстро переноситься на 4 степени кардиоплегии.
После нарезки пластиковые треугольники должны быть прикреплены перпендикулярно направлению волокна. Предварительная нагрузка не должна превышать 1500 млн. Биомиметическая культура срезов может помочь исследователям использовать генетические манипуляции, а также клеточную терапию для изучения регенерации и восстановления в миокарде взрослого человека.
