За последние десятилетия продолжительность жизни человека продлевается в связи с повышением уровня жизни и достижениями в области медицинской науки. Возраст является самым большим фактором риска для многих опасных для жизни заболеваний, в том числе нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезни Хантингтона. Здесь мы демонстрируем методологии, использующие некоторые универсальные новые методы моделей, включая гиперактивный ионный канал, индуцированный некроз, а белковые агрегаты индуцируют нейротоксичность, для мониторинга и вскрытия клеточного молекулярного механизма нервной дегенерации.
Пик здоровых личинок сделать четыре и сделать три Ньютон нематод на нематод роста медиа пластины, sieving с E.Coli с помощью вскрытия стерео микроскопа. Поместите десять и четыре нематод, паразитарные ферментные пластины и вырастить их при стандартной температуре, 20 градусов по Цельсию. Пять дней спустя, мыть пластины с 1 мл и 9 буфера и собирать животных в 1,5 мл трубки.
Центрифуга на 30 000 г в течение 30 секунд и удалить супернатант. Добавьте 0,5 мл покрытия раствора. Раствор Plating хранится при комнатной температуре.
Вихрь и периодически контролировать, пока все они не растворились. Избегайте покрытия в течение периодов более пяти минут. Центрифуга при 10 000 г в течение 30 секунд и удалить супернатант.
Вымойте в два раза палитру с 1 мл и девятью буферами. Центрифуга при 10000 г в течение 30 секунд и удалить супернатант. После мытья, повторно использовать яйца в 200 микролитров M9 буфера и инкубировать их в течение 25 минут, при 34 градусов по Цельсию в водяной бане.
Поддерживайте отдельную группу яиц при 20 градусах Цельсия. Pipette 100 микролитров, содержащих контроль или тепловой шок обработанные яйца и поместить их на несеяные 10 GN пластины. Каждая тарелка содержит не менее 100-200 яиц.
Инкубировать яйца при 20 градусах по Цельсию до вылупления. Используйте буфер M9 для мытья пластин и сбора L1 жизни и нематод в 1,5 мл трубки. Центрифуга при 10 000 г в течение 30 секунд.
Удалите супернатант и сохранить палитру. Добавьте 100 микролитров 20 миллимолярные левангиальные буферы M9 для обезболить нематод. Pipette 10 микролитров левого буфера M9, содержащий часы L1 и смонтировать их в 2%agar-ls месте мягко крышки в верхней части образца.
Наблюдайте часы с помощью микроскопии DIC. Сканирование дегенерации 630 рецепторных нейронов путем подсчета клеток с характерным виртуальным появлением этого нематода. Синхронизировать нематод путем выбора и передачи от 15 до 20 L4 личинок каждого в нагрузке на первую бактерию C, то ГМ пластин.
Инкубировать и пусть нематод расти при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию. Выполняем ежедневные предварительные условия в течение 30 минут, перенося пластины в инкубатор, установленный при 34 градусах по Цельсию. Затем верните предусловие нематод обратно при стандартной температуре 20 градусов по Цельсию.
Добавьте 10 микролитров 20 миллимолярной левой буферной капли M9 в центре места агар-л. Выберите соответствующие трансгенные нематоды и перенесите их в левангиальное падение M9. Место от 20 до 30 нематод за каплю.
Поместите аккуратно крышку скольжения на верхней части образца. Печать крышки скольжения с лаком для ногтей, чтобы сохранить влажность на протяжении всего процесса визуализации. С помощью флуоресцентного микроскопа в сочетании с камерой, обнаружить и захватить ваши исследования изображения области головы на 20 х увеличение.
Мониторинг семь дней трансгенных нематод для дофаминергической смерти нейрональных клеток. Измерьте нейрональные поликуловые агрегаты в области головы четырехдневных трансгенных животных, выражают 240 слияний с живыми людьми. Некротическая гибель клеток индуцированных гиперактивных ионных каналов является основным в нематод, который имеет бывший тепловой шок предварительных яйцеклеток.
Тепловой шок предпосылки, содействие прогноз против альфа-синуклеина индуцированной клеточной смерти в семидневный взрослый гермафродит и уменьшает 40 белковых агрегатов в области головы четырехдневных взрослых. Старение является следствием повреждения, вызванного постепенным вырождением клеточного и тканевого гомеостаза. Таким образом, понимание манипулирования возрастных нейронов сломать являются приоритетными местами.
Представленные методы в сочетании с генетикой и фармакологическими экранами могут привести к уведомлению о нормальных модуляторах смерти клеток с потенциальным терапевтическим интересом.
