過去数十年にわたり、生活水準の向上と医学の進歩により、人間の寿命が延びています。年齢は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含む多くの生命を脅かす疾患の最大の危険因子です。ここでは、神経変性の細胞分子機構を監視・解剖するために、超活性イオンチャネル誘導壊死やタンパク質凝集体を含む、いくつかの多目的な新しい方法モデルを用いた方法論を実証する。
ピークの健康に満ちた幼虫は4を作り、3つのニュートン線虫を線虫成長培地プレートに作り、解剖ステレオ顕微鏡を使用して大腸菌をふるいにかける。10個と4本の線虫、寄生酵素プレートを置き、摂氏20度の標準温度で成長させます。5日後、プレートを1 mLと9バッファーで洗浄し、1.5mLチューブで動物を採取します。
30,000gで30秒間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。0.5 mLのメッキ液を加えます。めっき液は室温で保存する。
ボルテックスとモニターは、それらがすべて溶解するまで定期的に行います。5分以上の間はめっきを避けてください。遠心分離機で10,000gで30秒間、上清を取り除きます。
1 mL と 9 つのバッファーでパレットを 2 回洗浄します。10000gで30秒間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。洗浄後、200マイクロリットルM9バッファーで卵を再懸濁し、水浴で摂氏34度で25分間インキュベートします。
摂氏20度で卵の別々のグループを維持します。コントロールまたはヒートショックを含むピペット100マイクロリットルは、卵を処理し、シードなし10 GNプレート上に置きます。各プレートには、少なくとも100〜200個の卵が含まれています。
孵化するまで20度摂氏で卵をインキュベートします。プレートを洗浄し、1.5 mlチューブ内のL1寿命と線虫を収集するために使用し、M9バッファ。遠心分離機は10,000gで30秒間。
上清を取り除き、パレットを保持します。線虫を麻酔するために20ミリモルM9レバンジアルバッファーの100マイクロリットルを加えます。ピペット10マイクロリットルのM9レバンジアルバッファーは、L1ウォッチを含み、サンプルの上部にそっとカバースリップを2%寒天-lsスポットに取り付けます。
DIC顕微鏡を用いて観察します。その線虫の特徴的な仮想援助外観を有する細胞を数えることによって630受容体ニューロンの変性をスキャンする。最初の細菌C、GMプレートの各菌株の15〜20 L4幼虫を選択して移送することによって線虫を同期させます。
インキュベートし、線虫が摂氏20度の標準温度で成長するようにしましょう。34°Cに設定されたインキュベーターでプレートを移して、毎日30分間のプレコンディショニングを行います。次に、予め調整された線虫を摂氏20度の標準温度に戻します。
寒天-lsスポットの中心に20ミリモルM9レバンギアルバッファードロップの10マイクロリットルを追加します。それぞれのトランスジェニック線虫を選び、M9レバンジアルドロップで転送します。1滴あたり20〜30線虫を配置します。
サンプルの上部にそっとカバースリップを置きます。マニキュアでカバースリップを密封し、イメージングプロセス全体の湿度を維持します。カメラと組み合わせた蛍光顕微鏡を使用して、20 x倍率でヘッド領域の研究画像を検出してキャプチャします。
ドーパミン作動性神経細胞死のためのトランスジェニック線虫の7日間を監視します。生きている人々との240の融合を発現する4日齢のトランスジェニック動物の頭部領域におけるニューロンのポリクル凝集体を測定する。壊死細胞死は、過剰活動性イオンチャネルを誘発し、かつての熱ショック予調卵を有する線虫の中で最も主要である。
ヒートショックプレコンディショニングは、7日齢の成人雌雄同体におけるα-シヌクレイン誘導細胞死に対する予測を促進し、4日齢成人の頭領域におけるQ40タンパク質凝集体を減少させる。老化は、細胞および組織恒常性の徐々に変性によって引き起こされる損傷の結果である。したがって、加齢に伴う神経の分解を操作する理解は、最優先事項です。
提示された技術は、遺伝学および薬理学的スクリーンと組み合わせることで、潜在的な治療上の関心を持つ正常な細胞死変調器の通知につながる可能性がある。
