지난 수십 년 동안 인간의 수명은 생활 수준 개선과 의학의 발전으로 인해 연장됩니다. 나이는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 과 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 가장 큰 위험 요소입니다. 여기서, 우리는 신경 변성의 세포 분자 메커니즘을 모니터링하고 해부하기 위해 하이퍼 액티브 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 응집체를 포함한 일부 다목적 새로운 방법 모델을 활용하여 방법론을 시연한다.
4개의 피크 건강 유충은 4를 만들고 해부 스테레오 현미경을 사용하여 E.Coli와 체질, 선충 성장 미디어 플레이트에 3 개의 뉴턴 선충을 합니다. 10및 4개의 선충, 기생 효소 플레이트를 놓고 표준 온도에서 섭씨 20도의 성장하십시오. 5일 후, 1mL와 9 버퍼로 접시를 씻고 1.5mL 튜브로 동물을 수집합니다.
30, 000g의 원심분리기는 30초 동안 상체를 제거합니다. 도금 용액0.5mL를 추가합니다. 도금 용액은 실온에 저장됩니다.
소용돌이와 모니터링은 모두 용해 될 때까지 주기적으로 모니터링합니다. 5분 이상 도금하지 마십시오. 원심분리기는 10, 000g에서 30초 동안 및 상부체를 제거합니다.
1mL과 9개의 버퍼로 팔레트를 두 번 씻으세요. 원심분리기는 10000g에서 30초 동안 상주분리기를 제거합니다. 세척 후, 200 마이크로 리터 M9 버퍼에서 계란을 다시 중단하고 25 분 동안 배양, 수조에서 섭씨 34도에서.
20도에서 별도의 계란 그룹을 유지하십시오. 제어 또는 열 충격을 포함하는 파이펫 100 마이크로 리터는 계란을 치료하고 시드되지 않은 10 GN 플레이트에 배치합니다. 각 접시에는 적어도 100~200개의 알이 들어 있습니다.
부화 때까지 20섭씨에서 계란을 배양합니다. 1.5ml 튜브에서 접시를 씻고 L1 생명과 선충을 수집하기 위해 M9 버퍼를 사용합니다. 원심 분리기 는 10, 000g에서 30 초 동안.
상체를 제거하고 팔레트를 유지합니다. 선충을 마취하기 위해 20 밀리머 M9 레반지 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. L1 시계를 함유하고 2% 아가-ls 스팟에 장착하여 시료 상단에 커버슬립을 부드럽게 장착하는 M9 레반디얼 버퍼의 파이펫 10 마이크로리터.
DIC 현미경 을 사용하여 시계를 관찰하십시오. 630 수용체 뉴런의 스캐닝 변성을 스캐닝하여 그 선충의 특징적인 가상 원조 외관을 가진 세포를 계산하여. 선충을 선택하고 15 ~20 L4 유충을 선택하 여 동기화 하 고 먼저 박테리아 C에 변형에 각각의 L4 애벌레 다음 GM 플레이트.
선충이 섭씨 20도의 표준 온도에서 자라도록 하십시오. 섭씨 34도에 설정된 인큐베이터로 플레이트를 전송하여 30분 동안 사전 컨디셔닝을 수행합니다. 그런 다음 조건전 선충을 섭씨 20도의 표준 온도에서 다시 반환합니다.
10 밀리머 M9 레강 버퍼 드롭의 10 마이크로 리터를 아가-ls 지점의 중앙에 추가합니다. 각각의 형질전환 선충을 선택하고 M9 레강형 낙하로 옮기. 20~30개의 선충을 한 방울당 놓습니다.
시료 위에 뚜껑을 부드럽게 놓습니다. 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 카메라와 결합된 형광 현미경을 사용하여 20 x 배율로 헤드 영역의 연구 이미지를 감지하고 캡처합니다.
도파민성 신경 세포 죽음에 대 한 형질 전환선충의 7 일을 모니터링. 살아있는 사람들과 240융합을 표현하는 4일간의 트랜스제닉 동물의 머리 부위에 있는 신경 폴리쿨 골재를 측정한다. 괴사 세포 죽음은 전 열 충격 전제 조건 계란을 가지고 선충에서 가장 주요 인활성 이온 채널을 유도.
열 충격 사전 조절, 7 일 된 성인 헤르마로디테에서 알파 시뉴클레인 유도 세포 죽음에 대한 예측을 촉진하고 4 일 된 성인의 머리 영역에서 Q40 단백질 응집체를 감소시킨다. 노화는 세포와 조직 항상성의 점진적 인 변성으로 인한 손상의 결과입니다. 따라서 노화와 관련된 뉴런 분해를 조작하는 것에 대한 이해는 최우선 순위입니다.
유전학 및 약리학적 스크린과 결합된 제시된 기술은 잠재적인 치료 관심사를 가진 일반적인 세포 죽음 변조기의 통지로 이끌어 낼 수 있었습니다.
