Эти протоколы имеют важное значение, поскольку они обеспечивают подробные шаги для проверки потенции и избирательности новых ингибиторов HAT, которые являются важными инструментами исследования и потенциальной терапии. Методы, продемонстрированые в этом видео, просты в работе и предоставляют информацию о влиянии ингибиторов HAT на глобальное и региональное ацетилирование гистон. Они делают возможным понимание эпигенетической регуляции экспрессии генов.
Внимание к деталям имеет решающее значение. Важно следовать протоколам шаг за шагом. Начните с подготовки энзиматической реакции в объеме 10 микролитров внутри 0,2 миллилитров ПЦР-трубки в соответствии с рукописными указаниями.
Затем инкубировать полную смесь реакции при 30 градусах по Цельсию в течение одного часа в тепловом циклере ПЦР. Между тем, добавьте два меркаптоэтанола в соотношении 1 к 10 к буферу образца 6X SDS. Удалите образцы из теплового цикла ПЦР и добавьте два микролитров подготовленного буфера образца SDS в каждую смесь реакции.
Нагрейте образцы до 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут на тепловой блок, а затем охладить их на льду. Храните образцы при температуре минус 20 или минус 80 градусов по Цельсию или приступайте к гелевому электрофорезу и иммуноблоттингу. Семя 100 000 клеток MCF-7 в одном миллилитре клеточной культуры среды в каждый колодец 12-хорошо пластины и позволяют клеткам расти до 80 до 90% слияния.
Когда клетки достигают желаемого слияния, аспирировать клеточной культуры среды из скважин четыре, пять и шесть, и пипетка один миллилитр из трех микромоляных MS275 в среде в каждой скважине. Затем аспирировать клеточной культуры среды из колодцев один, два и три, и пипетки один миллилитр разбавленной DMSO в каждой скважине. Вернуть клетки в инкубатор в течение четырех часов, чтобы обеспечить накопление ацетилированных гистонов в клетках, подверженных MS275.
Пока клетки инкубируются, подготовляй разбавления А-485 в ДМСО в соответствии с рукописными указаниями. Когда инкубация закончена, аспирировать среды из скважин и добавить разбавления. Вернуть клетки в инкубатор и культурировать их в течение 20 часов, а затем аспирировать клеточной культуры среды из колодцев и мыть клетки с одним миллилитром PBS.
Аспирировать PBS и добавить 100 микролитров пассивного буфера лиза. Храните тарелку при температуре минус 80 градусов по Цельсию на ночь. Pipette 100 микролитров sonicated хроматина из клеток, обработанных DMSO в две 1,5 миллилитровые трубки, затем пипетки 400 микролитров буфера разбавления ChIP к каждой трубке, чтобы довести общий объем до 500 микролитров.
Удалите пять микролитров раствора из одной из трубок и храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию при вводе DMSO. Приготовьте две трубки с звуковым хроматином из клеток, обработанных A-485 таким же образом. Используйте пипетку для добавления ацетил-антител IgG и H3K27 в образцы DMSO и A-485.
Затем добавьте 20 микролитров белка магнитных бусин в каждую трубку, убедившись, что бисер хорошо перерасход. Поверните образцы на ночь при четырех градусах по Цельсию. Пеллет белка магнитных бусин с помощью магнитного сепаратора и удалить супернатант, не нарушая бисера.
Вымойте шарики с 500 микролитров до одного миллилитра низкой соли мыть буфера и повернуть их в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Выполните быстро спина вниз, гранулы бисера с магнитным сепаратором и удалить супернатант. Повторите процедуру мытья с высоким буфером для мытья соли, буфером для мытья хлорида лития и буфером TE.
После мытья буфером TE удалите входные образцы из морозильной камеры и положите их на лед. Оттепель aliquot протеиназы K, а затем гранулы бисера с помощью магнитного сепаратора и удалить te буфер из бисера. Добавьте 100 микролитров буфера ChIP elution и один микролитр протеиназы K к каждому образцу, включая входные образцы, и инкубировать их тряской при 62 градусах по Цельсию в течение двух часов с помощью термоциклера.
После инкубации нагрейте образцы до 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем охладите их до комнатной температуры. Пеллет магнитных бусин с магнитным сепаратором и передачи ДНК-содержащих супернатантов в новую 1,5 миллилитровую трубку. Очистите ДНК с помощью стандартного комплекта очистки ПЦР и запустите qPCR.
Анализ ацетилтрансферазы in vitro был использован для исследования влияния анакардиновой кислоты на активность p300 HAT в направлении гистонового субстрата. Был протестирован диапазон концентрации и ацетил-КоА не был добавлен к негативной реакции контроля. Результаты иммуноблот были количественно с ImageJ, показывая явное снижение ацетил H3K18 и ацетил H3K9 на 100 микромоляновой анакардиновой кислоты по сравнению с dmSO контроля.
В анализе ингибирования хроматина гиперацетилирования, лечение клеток MCF-7 с HDACi MS275 сильно регулируется ацетилированием гистона 3 на нескольких остатках лизина. Базальные уровни ацетил H3K18 и ацетил H3K27 были низкими, показывая преимущества добавления HDACi в анализе ChHAI. Добавление A-485 в ячейках, предварительно обработав MS275, затухает повышенное ацетилирование гистона на H3K18 и H3K27, но не H3K9.
Иммунобло результаты были также количественно с ImageJ. ChIP qPCR был использован для исследования воздействия ингибиторов HAT на элементы регулирования генов, которые контролируют экспрессию онкогена. В образце DMSO, ДНК осаждается антитела контроля IgG производится более высокое значение Ct, чем ацетил H3K27 антитела в qPCR реакции на циклин D1 промоутер, что свидетельствует о том, что неспецифические IgG управления осаждали меньше ДНК гистон комплексов, чем ацетил H3K27 конкретных антител на промоутера.
По сравнению с управлением DMSO, A-485 сократил обогащение ацетил H3K27 на промоутере циклина D1. Важно отметить, что A-485, как известно, значительно уменьшить ацетил H3K27 в клеточной культуре. При попытке этого протокола, имейте в виду, что до инкубации шаги in vitro HAT и ChHAI анализы имеют важное значение и не должны быть забыты.
Важно также помнить, чтобы сохранить входные образцы и избежать потери бисера во время ChIP. После выполнения этих процедур, ChIP-seq является дополнительным методом, который может быть выполнен, чтобы получить глобальную информацию о ацетилировании гистон на нормативных элементов для всего генома. Эти протоколы полезны для ученых, чтобы тщательно проверить новые ингибиторы HAT и избежать публикации некачественных химических зондов в литературе.
Проверенные ингибиторы HAT могут проходить дальнейшее развитие в качестве потенциальной терапии.
