Автоматизация атомно-силового микроскопа является ключевой инновацией в эволюции технологии в направлении биомедицинских применений. Это также открывает доступ к исследованию биомеханических свойств клеточных популяций. Наш метод позволяет записывать измерения AFM для 1000 клеток за четыре часа, по сравнению с обычными методами, которые занимают четыре часа для измерения 10 клеток, это действительно значительный выигрыш времени.
Если автоматизация является необходимым условием для приведения этой технологии в больничные лаборатории, этот протокол доказательства концепции предполагает ее потенциал для использования в разработке конкретных медицинских диагностических стратегий. Этот протокол использует универсальный стержень PDMS, который может быть заполнен различными микробами, что позволяет исследовать различные системы. Для приготовления штампа PDMS смешайте 55 граммов раствора преполимерного раствора PDMS в соотношении масс 10 к одному в PDM, олигомерах и отверждающем агенте и дегазируйте полученный раствор под вакуумом в один раз 10 до отрицательного один к одному раз 10 к отрицательным двум барам в течение пяти-10 минут.
Когда все пузырьки ловушек будут удалены, вылейте 20 граммов дегазированного раствора на силиконовую главную форму толщиной от двух до трех миллиметров и снова дегазуйте. Когда все пузырьки будут удалены, сетчаться PDMS при 80 градусах Цельсия в течение одного часа и использовать скальпель, чтобы разрезать микроструктурированную печать PDMS параллельно видимым массивам микроструктуры. Затем снимите штамп с силиконовой мастер-формы и поместите сайт микроструктуры штампа вверх на стеклянный слайд с микроструктурами, выровненными со стороной слайда.
Чтобы подготовить ячейки к устройству, центрифугируют 600 микролитров интересующей ячейки суспензии и добавляют 200 микролитров супернатанта на штамп. Дегазить супернатант под вакуумом в течение примерно 40 минут. Когда все пузырьки будут удалены, замените супернатант с поверхности PDMS 200 микролитрами повторно суспендированного клеточного раствора для 15-минутной инкубации при комнатной температуре.
Чтобы загрузить ячейки в микроструктуры штампа, используйте стеклянный слайд, удерживаемый под углом от 30 до 50 градусов, чтобы распределить ячейки по штампу в обоих направлениях, несколько раз по мере необходимости. Когда достигнута высокая скорость заполнения микроструктур, используйте пипетку для удаления клеточной суспензии и промывайте три раза одним миллилитром ацетатного буфера за одну промывку, чтобы удалить любые незацепленные ячейки. После последней промывки используйте поток азота, чтобы высушить заднюю часть образца и поместите штамп в чашку Петри.
Затем добавьте в блюдо два миллилитра свежего ацетатного буфера. Для атомно-силовой микроскопии клеток поместите тарелку на сцену атомно-силового микроскопа и центрируете сцену от нуля до нуля. Когда сцена будет центрирована, переместите чашку в держатель чашки Петри микроскопа и выровняйте край штампа так, чтобы он был перпендикулярен оси Y держателя чашки Петри.
Затем поместите головку атомного микроскопа на сцену, позаботясь о том, чтобы шаговые двигатели были достаточно вытянуты, чтобы избежать столкновения наконечника с штампом. Для визуализации используйте ручки микроскопа, чтобы центрировать наконечник атомно-силового микроскопа над левым углом скважин с площадью 4,5 на 4,5 квадратных микрометра и выбрать режим картирования силы в программном обеспечении микроскопа. Чтобы установить карту сил 64 на 64 на площади 100 на 100 микрометров, установите относительное заданное значение от трех до пяти наноньютонов, длину Z до четырех микрометров, движение Z до постоянной длительности, время продления до 0,01 секунды, задержку расширения до нуля, задержку втягивания до нуля, режим задержки до постоянной силы , частота дискретизации до 2048 Гц.
Снимите флажок Z замкнутый цикл и проверьте квадратное изображение. Установите быстрый доступ к 100 микрометрам, медленную ось до 100 микрометров, смещение X к нулю микрометру, смещение Y к нулю микрометров, угол сетки до нуля градусов, пиксели до 64 на 64 и отношение пикселей к одному. Затем откройте программное обеспечение автоматизации.
Во всплывающем окне выберите путь к файлу сценария. Введите координату W1 в строке переменной P1 239 секции поля ввода скрипта gyfon и значение координаты W2 в строке переменной P2 241. Отнесем значение шага к переменной линии 245 шага скрипта и введите размер скважины, который может быть определен из проектирования паттернов скважины в линию переменной W-S 248.
Запишите путь к каталогу сохранения в строке 251 для сохранения данных в нужном месте и установите переменную общей площади строки 254 на желаемую на несколько концов 100 микрометров. Затем задайте кривые силы матрицы строки и столбца, записанные для каждой скважины в переменной number scans строки 257 и нажмите кнопку run, чтобы запустить программу. Чтобы проанализировать данные, используйте программное обеспечение video studio code, чтобы открыть скрипт Python и выполнить копирование файлов Скрипт Python для организации файлов кривой силы в одну папку.
Введите путь к общей папке, в которой будут храниться данные. для анализа силовых кривых, откройте атомно-силовой микроскоп производителя программного обеспечения для обработки данных. В меню файл выберите пакет кривых спектроскопии.
Затем выберите файл и процесс загрузки, а затем выберите процесс жесткости. Выберите последний шаг процесса и нажмите сохранить и применить ко всем, чтобы все кривые силы получали одинаковую обработку. Чтобы открыть скрипт R, загрузите файлы, содержащие информацию, извлеченную с помощью программного обеспечения для обработки данных, в программное обеспечение R studio.
В окне среды щелкните Импорт набора данных и во всплывающем окне средства чтения текста нажмите кнопку Обзор, чтобы найти файл TSV с точками. После загрузки файла выберите область выполнения кода и запустите все, чтобы выполнить весь код. Здесь показаны типичные гистограммы, полученные с использованием показанного протокола.
В этом анализе перераспределение жесткости было зарегистрировано на 957 нативных клетках, в то время как в этом анализе была измерена жесткость 574 клеток, обработанных каспофунгином. Знайте, что использование сотен ячеек позволяет наблюдать бимодальное распределение значений. В небольших выборках обычно наблюдается однократное распределение, которое может привести к отсутствию наблюдения за гетерогенностью популяции.
Сравнение двух состояний подчеркивает влияние Каспофунгина на снижение жесткости клеток. В результате сравнения ANOVA нативных и обработанных клеток эти два состояния демонстрируют высокую, значительно различную жесткость. Это значение было достигнуто за счет большого количества анализируемых клеток, обеспечивающих большую уверенность в полученных результатах.
Добавление супернатанта к штампу PDMS перед многократной промывкой ячеек в скважины до тех пор, пока штамп не будет заполнен, имеет решающее значение для успеха анализа. В этом доказательстве концепции были проанализированы клетки Candida albicans, но протокол может быть применен к любой группе клеток-паттернов, молекул или материалов.
