원자력 현미경 자동화는 생체 의학 응용 분야로 기술의 진화에 핵심 혁신이다. 그것은 또한 세포 집단의 생체 역학적 특성의 조사에 대한 액세스를 엽니 다. 우리의 방법은 10 세포를 측정하는 데 4 시간이 걸리는 일반적인 방법에 비해 4 시간 동안 1, 000 셀에 대한 AFM 측정값을 기록 할 수 있게해주며, 이것은 실제로 상당한 시간 이득입니다.
자동화가 이 기술을 병원 실험실로 가져오는 전제 조건인 경우, 이 개념 증명 프로토콜은 특정 의료 진단 전략 개발에 사용할 수 있는 잠재력을 시사합니다. 이 프로토콜은 다양한 미생물로 채워질 수 있는 다목적 PDMS 스템을 사용하여 다양한 시스템을 탐구할 수 있습니다. PDMS 스탬프를 준비하려면 55그램의 PDMS 프리폴리머 용액을 PDM, 올리고머 및 경화제에서 10 대 1 질량 비율로 혼합하고 5~10분 동안 음수 2개의 막대에 10번 또는 10번 으로 진공 상태에서 생성된 용액을 분해한다.
모든 트랩 버블이 제거되면 20그램의 탈가스 용액을 실리콘 마스터 몰드에 2~3mm 두께로 붓고 다시 데가스를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면 PDMS를 섭씨 80도에서 1시간 동안 reticulate화하고 메스를 사용하여 PDMS 마이크로 구조스탬프를 보이는 미세 구조 의 어레이와 평행하게 자른다. 그런 다음 실리콘 마스터 몰드에서 스탬프를 벗기고 슬라이드 측면과 정렬된 마이크로 구조와 함께 스탬프 마이크로 구조 부위를 유리 슬라이드에 올려 놓습니다.
장치에 대한 세포를 준비하기 위해, 관심의 세포 현탁액의 원심 분리기 600 마이크로 리터와 스탬프에 상피의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 약 40 분 동안 진공 상태에서 상체를 탈가스. 모든 기포가 제거되면 PDMS 표면에서 상체를 실온에서 15분 동안 재중단 된 셀 용액의 200 마이크로 리터로 교체하십시오.
스탬프의 마이크로 구조에 셀을 로드하려면 30~50도 각도로 유지되는 유리 슬라이드를 사용하여 필요에 따라 여러 번 스탬프에 셀을 분산시합니다. 미세 구조의 높은 충전 속도가 달성된 경우, 파이펫을 사용하여 세포 현탁액을 제거하고 세척당 아세테이트 버퍼 1밀리리터로 세 번 세척하여 묶지 않은 세포를 제거합니다. 마지막 세척 후 질소 흐름을 사용하여 샘플 의 뒷면을 건조시키고 스탬프를 페트리 접시에 놓습니다.
그런 다음 신선한 아세테이트 버퍼 2 밀리리터를 접시에 넣습니다. 세포의 원자력 현미경 검사의 경우, 접시를 원자력 현미경 단계에 놓고 무대를 0에서 0으로 중심으로 합니다. 스테이지가 중심이 되면 접시를 현미경 페트리 접시 홀더로 옮기고 스탬프 가장자리를 정렬하여 페트리 접시 홀더의 y축에 수직이 되도록 합니다.
그런 다음 원자 현미경 힘 헤드를 무대에 배치하여 스텝퍼 모터가 스탬프에 충돌하는 팁을 피하기 위해 충분히 확장되는 것을 주의하십시오. 이미징의 경우 현미경 노브를 사용하여 4.5 x 4.5 제곱 마이크로 미터 우물의 왼쪽 모서리에 원자력 현미경 팁을 중앙에 두고 현미경 소프트웨어에서 힘 매핑 모드를 선택합니다. 100 x 100 마이크로미터 면적에 걸쳐 64 x 64 힘 맵을 설정하려면 상대 설정 점을 3~5나노 뉴턴으로 설정하고, Z 길이를 4마이크로미터로 설정하고, Z 이동은 일정한 지속 시간, 연장 시간 내지 0.01초로 연장시간, 연장 지연을 0으로, 지연 지연 모드를 0으로, 지연 모드를 일정한 힘으로 설정합니다. , 2048 헤르츠에 샘플 속도.
Z 닫힌 루프의 선택을 취소하고 정사각형 이미지를 확인합니다. 100 마이크로미터에 빠른 액세스를 설정, 100 마이크로 미터에 느린 축, 제로 마이크로 미터에 X 오프셋, 제로 마이크로 미터에 Y 오프셋, 0 마이크로 미터에 그리드 각도, 픽셀 64 x 64, 그리고 픽셀 비율을 1 대 1. 그런 다음 자동화 소프트웨어를 엽니다.
팝업 창에서 스크립트 파일을 향한 경로를 선택합니다. P2 가변 선(241)의 자이폰 스크립트의 입력 상자 섹션의 P1 가변 선(239)과 W2 좌표값의 W1 좌표를 입력합니다. 피치 값을 스크립트의 피치 가변 선(245)에 특성화하고 웰 치수를 입력하여 웰 패턴의 설계에서 W-S 가변 선(248)으로 결정합니다.
원하는 위치에 데이터를 저장하고 총 면적 변수 라인(254)을 100 마이크로미터의 여러 끝에 대한 욕망으로 설정하려면 251줄에 저장 디렉토리로 경로를 작성합니다. 그런 다음 숫자 스캔 변수 라인(257)에 잘 기록된 힘 곡선 행렬 행과 열을 설정하고 실행을 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 데이터를 분석하려면 비디오 스튜디오 코드 소프트웨어를 사용하여 Python 스크립트를 열고 파이썬 스크립트 복사 파일을 실행하여 힘 곡선 파일을 하나의 폴더로 구성합니다.
데이터가 저장될 일반 폴더에 경로를 입력합니다. 힘 곡선을 분석하려면 원자력 현미경 제조업체의 데이터 처리 소프트웨어를 엽니다. 파일 메뉴에서 분광학 곡선 배치를 선택합니다.
다음으로 파일 및 로드 프로세스를 선택하고 강성 프로세스를 선택합니다. 프로세스의 마지막 단계를 선택하고 모든 힘 곡선이 동일한 처리를 받을 수 있도록 유지를 클릭하고 모든 사람에게 적용합니다. R 스크립트를 열려면 데이터 처리 소프트웨어로 추출된 정보가 포함된 파일을 R 스튜디오 소프트웨어에 로드합니다.
환경 창에서 데이터 집합 가져오기와 팝업 창의 텍스트 판독기에서 가져오기를 클릭하고 찾아보기를 클릭하여 도트 TSV 파일을 찾습니다. 파일이 로드되면 코드 실행 영역을 선택하고 모든 코드를 실행합니다. 여기서, 입증된 바와 같이 프로토콜을 사용하여 얻은 전형적인 히스토그램이 도시된다.
본 분석에서, 강성 재분할은 957개의 네이티브 셀에 기록되었지만, 이 분석에서는 574캐스포풍처리세포의 강성을 측정하였다. 수백 개의 셀을 사용하면 값의 이중 모달 분포를 관찰할 수 있습니다. 더 작은 샘플에서 단일 분포는 전형적으로 관찰되며 인구 이질성에 대한 관찰의 부족을 초래할 수 있습니다.
두 조건의 비교는 세포 강성을 감소에 Caspofungin의 효과 강조. 네이티브 및 처리 된 세포의 ANOVA 비교에 의해 밝혀, 두 조건은 높게 전시, 상당히 상이한 강성. 이 값은 많은 수의 분석된 세포로 인해 도달하여 얻어진 결과에 대한 더 큰 확신을 제공했습니다.
스탬프가 가득 차면 세포를 우물로 반복적으로 플러시하기 전에 PDMS 스탬프에 상체를 추가하는 것은 분석의 성공에 매우 중요합니다. 개념의 이 증명에서, 칸디다 알비칸스 세포는 분석되었지만 프로토콜은 패턴 세포, 분자 또는 물질의 임의의 그룹에 적용될 수 있다.
