L'automazione del microscopio a forza atomica è un'innovazione chiave nell'evoluzione della tecnologia verso applicazioni biomediche. Apre inoltre l'accesso allo studio delle proprietà biomeccaniche delle popolazioni cellulari. Il nostro metodo consente di registrare le misurazioni AFM per 1.000 cellule in quattro ore, rispetto ai metodi usuali, che ci vengono necessarie quattro ore per misurare 10 cellule, questo è davvero un guadagno significativo di tempo.
Se l'automazione è un prerequisito per portare questa tecnologia nei laboratori ospedalieri, questo protocollo proof of concept suggerisce il suo potenziale per l'uso nello sviluppo di specifiche strategie diagnostiche mediche. Questo protocollo utilizza uno stelo PDMS versatile che può essere riempito con vari microbi che consentono di esplorare diversi sistemi. Per preparare il timbro PDMS, mescolare 55 grammi di soluzione prepolimeria PDMS con un rapporto di massa 10 a uno in PDM, oligomeri e agente polimerizzante e degasare la soluzione risultante sotto vuoto a uno per 10 a quello negativo a uno per 10 alle due barre negative per cinque-10 minuti.
Quando tutte le trappole sono state rimosse, versare 20 grammi della soluzione degassata su uno stampo master in silicio a uno spessore da due a tre millimetri e degasare di nuovo. Una volta rimosse tutte le bolle, reticolare il PDMS a 80 gradi Celsius per un'ora e utilizzare un bisturi per tagliare il timbro micro strutturato PDMS parallelo agli array di microstrutture visibili. Quindi sbucciare il timbro dallo stampo principale in silicio e posizionare il sito della microstruttura del timbro su uno scivolo di vetro con le micro strutture allineate con il lato della diapositiva.
Per preparare le celle per il dispositivo, centrifugare 600 microlitri della sospensione cellulare di interesse e aggiungere 200 microlitri del supernatante sul timbro. Degasare il supernatante sotto vuoto per circa 40 minuti. Una volta rimosse tutte le bolle, sostituire il supernatante dalla superficie PDMS con 200 microlitri della soluzione cellulare rimorsinata per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.
Per caricare le celle nelle micro strutture del timbro, utilizzare una diapositiva di vetro tenuta con un angolo da 30 a 50 gradi per distribuire le celle attraverso il timbro in entrambe le direzioni, più volte se necessario. Quando è stata raggiunta un'elevata velocità di riempimento delle microstrutture, utilizzare una pipetta per rimuovere la sospensione cellulare e lavare tre volte con un millilitro di tampone di acetato per lavaggio per rimuovere eventuali celle non tracciate. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare il flusso di azoto per asciugare la parte posteriore del campione e posizionare il timbro in una piastra di Petri.
Quindi aggiungere due millilitri di tampone di acetato fresco al piatto. Per la microscopia a forza atomica delle cellule, posizionare il piatto sullo stadio del microscopio a forza atomica e centrare lo stadio da zero a zero. Una volta centrato il palco, spostare la piastra nel supporto della piastra di Petri al microscopio e allineare il bordo del timbro in modo che sia perpendicolare all'asse y del portapiacchi di Petri.
Quindi posizionare la testa di forza del microscopio atomico sul palco, facendo attenzione che i motori stepper siano sufficientemente estesi per evitare che la punta si schianti sul timbro. Per l'imaging, utilizzare le manopole del microscopio per centrare la punta del microscopio a forza atomica sull'angolo sinistro dei pozzi del micrometro quadrati da 4,5 per 4,5 e selezionare la modalità di mappatura della forza nel software del microscopio. Per impostare una mappa di forza 64 per 64 su un'area di 100 per 100 micrometri, impostare il set point relativo su tre o cinque nano Newton, la lunghezza Z a quattro micrometri, il movimento Z a durata costante, il tempo di estensione a 0,01 secondi, il ritardo di estensione a zero, il ritardo di retrazione a zero, la modalità di ritardo alla forza costante , la frequenza di campionamento a 2048 Hertz.
Deselezionare Z ciclo chiuso e controllare l'immagine quadrata. Impostare l'accesso rapido a 100 micrometri, l'asse lento a 100 micrometri, l'offset X a zero micrometri, l'offset Y a zero micrometri, l'angolo della griglia a zero gradi, i pixel a 64 per 64 e il rapporto pixel a uno a uno. Aprire quindi il software di automazione.
Nella finestra popup selezionare il percorso verso il file di script. Immettete la coordinata W1 nella linea variabile P1 239 della sezione della casella di input dello script gyfon e il valore della coordinata W2 nella linea variabile P2 241. Attribui il valore di intonazione alla linea variabile di passo 245 dello script e inserisci la dimensione del pozzo, che può essere determinata dalla progettazione dei modelli di pozzo nella linea variabile W-S 248.
Scrivere il percorso della directory di salvataggio nella riga 251 per salvare i dati nel punto desiderato e impostare la linea variabile dell'area totale 254 sul desiderio di più estremità dei 100 micrometri. Quindi impostare la riga della matrice delle curve di forza e la colonna registrata per pozzo nella linea variabile 257 di scand elenco numeri e fare clic su Esegui per avviare il programma. Per analizzare i dati, usa il software di codice dello studio video per aprire lo script Python ed eseguire lo script Python dei file di copia per organizzare i file della curva di forza in un'unica cartella.
Immettere il percorso della cartella generale in cui verranno archiviati i dati. per analizzare le curve di forza, aprire il software di elaborazione dei dati del produttore del microscopio a forza atomica. Nel menu file, selezionate batch di curve di spettroscopia.
Selezionare quindi il processo di file e caricamento e selezionare il processo di rigidità. Selezionare l'ultimo passaggio del processo e fare clic su Mantieni e applica a tutti in modo che tutte le curve di forza ricevano lo stesso trattamento. Per aprire lo script R, caricare i file contenenti le informazioni estratte con il software di elaborazione dati nel software R studio.
Nella finestra dell'ambiente fare clic su Importa set di dati e dal lettore di testo nella finestra popup fare clic su sfoglia per individuare il file TSV punto. Una volta caricato il file, selezionare l'area di esecuzione del codice ed eseguire tutto per eseguire tutto il codice. Qui vengono mostrati gli istogrammi tipici ottenuti utilizzando il protocollo come dimostrato.
In questa analisi, la ripartizione della rigidità è stata registrata su 957 cellule native, mentre in questa analisi è stata misurata la rigidità di 574 cellule trattate con caspofungin. Sappiate che l'utilizzo di centinaia di cellule consente di osservare una distribuzione bidomobile dei valori. Nei campioni più piccoli, una singola distribuzione è tipicamente osservata e può causare la mancanza di osservazione dell'eterogeneità della popolazione.
Un confronto delle due condizioni evidenzia gli effetti di Caspofungin sulla riduzione della rigidità cellulare. Rivelato dal confronto ANOVA delle cellule native e trattate, le due condizioni mostrano rigidità molto, significativamente diverse. Questo valore è stato raggiunto a causa del gran numero di cellule analizzate, fornendo una maggiore fiducia nei risultati ottenuti.
L'aggiunta del supernatante al timbro PDMS prima di sciacquare ripetutamente le celle nei pozzi fino a quando il timbro non è pieno, è fondamentale per il successo dell'analisi. In questa dimostrazione di concetto, le cellule di Candida albicans sono state analizzate, ma il protocollo può essere applicato a qualsiasi gruppo di cellule pattern, molecole o materiali.
