Como o ATP é um importante mensageiro celular, desenvolvemos um método que nos permite medir a ligação do ATP aos seus receptores com alta precisão. Usando FRET entre derivados de nucleotídeos e proteínas marcadas fluorescentemente, podemos monitorar a ligação de nucleotídeos a receptores funcionais intactos em tempo real e com excelente resolução espacial. Usamos este método para entender os efeitos do metabolismo celular sobre o canal de potássio sensível ao ATP, que está implicado em certas formas de diabetes.
Para montar um experimento de membrana sem teto, primeiro use um par de pinças para quebrar um pequeno fragmento de uma tampa com células transfectadas e enxaguar o fragmento com PBS. Se a tampa for pré-revestida com polilisina, coloque o fragmento no fundo de uma placa de 35 milímetros contendo dois mililitros de PBS e segure um sonicador de sonda de três milímetros três a cinco milímetros acima da amostra, pulsando a 50 watts e 20 a 40% de amplitude por 200 a 500 milissegundos para destedilhar as células. Se as lamínulas da tampa não forem pré-revestidas, após o enxágue com PBS, mergulhe o fragmento em um tubo contendo poli-L-lisina a 0,1% por cerca de 30 segundos antes de destelhar as células com breve sonicação, conforme demonstrado.
Transfira o fragmento sonicado para um fundo de vidro coberto de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução de banho e monte o prato em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em água de alta abertura numérica 60x. Verifique se a porta da câmera do microscópio está conectada a um espectrógrafo em série com uma câmera CCD de alta sensibilidade e use uma bomba peristáltica para perfundir a câmara de banho com tampão a uma taxa de fluxo de 0,5 a um mililitro de tampão por minuto. Para identificar fragmentos de membrana sem telhado expressando o canal marcado com ANAP, visualize a amostra para localizar membranas com canais fluorescentes.
Acople parcialmente a máscara do espectrômetro entre a porta da câmera no microscópio e o espectrógrafo. A sombra da máscara aparecerá na imagem da câmera. Adquira uma imagem de campo brilhante e fluorescência da membrana descoberta para permitir a seleção da região de interesse para análise.
Aproximar a ponta do sistema de perfusão de microvolume da membrana destelhada. Para obter uma imagem de fluorescência ANAP, excite a membrana com um LED de 385 nanômetros através de um filtro de excitação de passagem de banda de 390/18 nanômetros e um dicroico de borda de 416 nanômetros, coletando a luz emitida através de um filtro de emissão passa-longa de 400 nanômetros. Acione a máscara do espectrômetro e certifique-se de que a luz emitida seja passada.
Alinhe a região de interesse com a fenda da máscara do espectrômetro. Acione as grades do espectrômetro. Com as grades no lugar, a luz difratada pelo espectrômetro será projetada no chip da câmera CCD para produzir imagens espectrais.
As imagens reterão informações espaciais na dimensão Y. A dimensão X será substituída pelo comprimento de onda. Durante a perfusão com solução tampão livre de nucleotídeos, obtenha uma ou mais exposições de 0,1 a dez segundos para correção a jusante e normalização dos dados coletados ao longo do restante do experimento.
Em seguida, aplique uma faixa de concentrações de TNP ATP na solução de banho para estabelecer uma curva de resposta à concentração, perfundindo cada solução por pelo menos um minuto para garantir que um estado estacionário seja atingido e obter uma exposição para cada concentração. Após cada concentração, lave o TNP ATP com solução de banho livre de nucleotídeos por pelo menos um minuto antes de adquirir uma imagem de exposição pós-tratamento. Para realizar um experimento de fluorometria patch-clamp, primeiro puxe pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato de paredes espessas para uma resistência de 1,5 a 2,5 megaohms quando preenchidas com solução de pipeta.
Em seguida, transfira uma tampa com células transfectadas para uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução de banho e monte a placa no microscópio invertido. Perfundir a câmara de banho com solução de banho e identificar uma célula expressando canais marcados com ANAP. Aplique uma pressão positiva suave em uma pipeta de remendo e coloque a pipeta em uma câmara de banho.
Pressione a pipeta contra a membrana da célula e aplique uma sucção suave para obter uma vedação gigaohm. Para excisar o adesivo, mova rapidamente o suporte da pipeta para longe da célula remendada. Aproximar a ponta da pipeta do remendo da ponta do sistema de perfusão e verificar se o adesivo está dentro da fenda da máscara do espectrômetro.
Em seguida, aplique TNP ATP e colete espectros de imagem. Nessas imagens, um fragmento típico de membrana sem telhado de uma célula HEK293T expressando canais de potássio sensíveis ao ATP marcados com proteína fluorescente laranja pode ser observado. Nesta imagem espectral de canais de potássio sensíveis a ATP marcados com ANAP em uma membrana descoberta de uma célula HEK293T exposta a cinco TNP ATP micromolares, duas regiões de alta intensidade podem ser observadas que correspondem ao pico de emissão de ANAP e TNP ATP.
Um espectro final pode ser obtido subtraindo-se o espectro de fundo médio da região média do espectro de interesse. Aqui, pode-se observar a redução do pico de fluorescência da ANAP após múltiplas exposições. O pico de fluorescência de várias exposições na ausência de TNP ATP foi ajustado a um único decaimento exponencial.
Esses dados foram então utilizados para correção dos artefatos de fotoclareamento. Aqui, imagens espectrais representativas de uma membrana sem telhado obtidas de uma célula expressando canais de potássio sensíveis a ATP marcados com ANAP na ausência e na presença de TNP ATP são mostradas. A observação dos espectros de emissão corrigidos revela uma separação clara entre a emissão fluorescente doadora e aceptora.
Nesta figura, correntes representativas e espectros de canais de potássio sensíveis a ATP marcados com ANAP de um experimento típico de fluorometria patch-clamp são mostrados. Os espectros de emissão são corrigidos para fundo e branqueamento, como demonstrado para membranas sem telhado. Tome cuidado com os controles para verificar se o sinal fluorescente é específico para o seu receptor.
Certifique-se de que sua profusão seja rápida, eficiente e completa e mantenha suas exposições o mais curtas possível. Este método responde a perguntas sobre a ocupação do receptor e como ele se relaciona com a função. Outras técnicas de FRET usadas com uma configuração semelhante podem sondar alterações confirmacionais induzidas pelo ligante no receptor.
