ATP는 중요한 세포 메신저이기 때문에 우리는 수용체에 대한 ATP 결합을 매우 정밀하게 측정할 수 있는 방법을 개발했습니다. 뉴클레오티드 유도체와 형광 태그가 부착된 단백질 사이에 FRET를 사용하여 온전한 기능적 수용체에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 우수한 공간 분해능으로 모니터링할 수 있습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 특정 형태의 당뇨병과 관련된 ATP 민감성 칼륨 채널에 대한 세포 대사의 영향을 이해합니다.
지붕이 없는 멤브레인 실험을 설정하려면 먼저 한 쌍의 집게를 사용하여 형질감염된 세포가 있는 커버 슬립에서 작은 조각을 부수고 PBS로 조각을 헹굽니다. 커버 슬립이 폴리리신으로 사전 코팅된 경우 2밀리리터의 PBS가 들어 있는 35mm 접시의 바닥에 조각을 놓고 샘플 위의 3mm 프로브 초음파 처리기를 3-5mm 위로 잡고 200-500밀리초 동안 50와트 및 20-40% 진폭으로 펄스하여 셀의 지붕을 뜯습니다. 커버 슬립이 미리 코팅되지 않은 경우 PBS로 헹군 후 0.1% 폴리-L-라이신이 들어있는 튜브에 조각을 약 30 초 동안 담그고 간단한 초음파 처리로 세포를 지붕을 뜯습니다.
초음파 처리 된 조각을 2 밀리리터의 목욕 용액이 들어있는 덮인 유리 바닥 35 밀리미터 접시로 옮기고 높은 수치 조리개 60x 침수 대물렌즈가 장착 된 도립 현미경에 접시를 장착합니다. 현미경의 카메라 포트가 고감도 CCD 카메라와 직렬로 분광기에 연결되어 있는지 확인하고 연동 펌프를 사용하여 분당 0.5-1밀리리터의 버퍼 유속으로 버퍼로 욕조 챔버를 관류합니다. ANAP 표지 채널을 발현하는 지붕이 없는 멤브레인 단편을 식별하려면 샘플을 보고 형광 채널이 있는 멤브레인을 찾습니다.
현미경의 카메라 포트와 분광기 사이의 분광계 마스크를 부분적으로 맞춥니다. 마스크의 그림자가 카메라 이미지에 나타납니다. 지붕이 없는 멤브레인의 명시야 및 형광 이미지를 획득하여 분석을 위한 관심 영역을 선택할 수 있습니다.
마이크로볼륨 관류 시스템의 끝을 지붕이 없는 멤브레인에 가까이 가져옵니다. ANAP 형광 이미지를 획득하려면 390/18 나노미터 대역 통과 여기 필터와 416 나노미터 에지 이색성을 통해 385 나노미터 LED로 멤브레인을 여기시키고 400 나노미터 롱패스 방출 필터를 통해 방출된 빛을 수집합니다. 분광계 마스크를 끼우고 방출된 빛이 통과하는지 확인합니다.
관심 영역을 분광계 마스크의 슬릿에 맞춥니다. 분광계 격자를 작동시킵니다. 격자가 제자리에 있으면 분광계에 의해 회절된 빛이 CCD 카메라의 칩에 투사되어 스펙트럼 이미지를 생성합니다.
이미지는 Y 차원의 공간 정보를 유지합니다. X 차원은 파장으로 바뀝니다. 뉴클레오티드 없는 완충 용액으로 관류하는 동안, 실험의 나머지 부분에 걸쳐 수집된 데이터의 다운스트림 보정 및 정규화를 위해 하나 이상의 0.1 내지 10초 노출을 수득한다.
다음으로, 수조 용액에 다양한 TNP ATP 농도를 적용하여 농도 반응 곡선을 설정하고, 각 용액을 최소 1분 동안 관류하여 정상 상태에 도달하고 각 농도에 대한 노출을 얻습니다. 각 농축 후, 처리 후 노출 이미지를 획득하기 전에 적어도 1분 동안 뉴클레오티드 없는 목욕 용액으로 TNP ATP를 세척합니다. 패치 클램프 형광 측정 실험을 수행하려면 먼저 피펫 용액으로 채워질 때 두꺼운 벽으로 둘러싸인 붕규산 유리 모세관에서 패치 피펫을 1.5-2.5메가옴의 저항으로 당깁니다.
다음으로, 형질주입된 세포가 있는 커버 슬립을 2밀리리터의 수조 용액이 들어 있는 유리 바닥 35mm 접시에 옮기고 접시를 도립 현미경에 장착합니다. 목욕 용액으로 목욕 챔버를 관류하고 ANAP 표지 채널을 발현하는 세포를 식별합니다. 패치 피펫에 부드러운 양압을 가하고 피펫을 욕조 챔버에 넣습니다.
피펫을 세포의 멤브레인에 대고 부드럽게 흡입하여 기가옴 밀봉을 달성합니다. 패치를 절제하려면 피펫 홀더를 패치된 셀에서 빠르게 멀리 옮깁니다. 패치 피펫의 끝을 관류 시스템의 끝 부분에 가깝게 가져오고 패치가 분광계 마스크의 슬릿 내에 있는지 확인합니다.
그런 다음 TNP ATP를 적용하고 이미지 스펙트럼을 수집합니다. 이 이미지에서 주황색 형광 단백질로 태그된 ATP 민감성 칼륨 채널을 발현하는 HEK293T 세포의 전형적인 지붕이 없는 막 단편을 관찰할 수 있습니다. 5 마이크로몰 TNP ATP에 노출된 HEK293T 세포로부터의 지붕이 없는 막에서 ANAP 태그된 ATP 민감성 칼륨 채널의 이러한 스펙트럼 이미지에서, ANAP 및 TNP ATP의 피크 방출에 상응하는 고강도의 2개의 영역이 관찰될 수 있다.
최종 스펙트럼은 평균화된 관심 영역 스펙트럼으로부터 평균화된 배경 스펙트럼을 뺀 것에 의해 얻어질 수 있다. 여기서, 다중 노출 후 피크 ANAP 형광의 감소가 관찰될 수 있다. TNP ATP가 없는 상태에서 여러 번의 노출로 인한 피크 형광은 단일 지수 붕괴에 적합했습니다.
그런 다음 이 데이터를 사용하여 광표백 아티팩트를 수정했습니다. 여기서, TNP ATP의 부재 및 존재 하에서 ANAP 태깅된 ATP 민감성 칼륨 채널을 발현하는 세포로부터 얻어진 지붕이 없는 막으로부터의 대표적인 스펙트럼 이미지가 도시된다. 보정된 방출 스펙트럼을 관찰하면 공여체와 수용체 형광 방출 사이의 명확한 분리가 나타납니다.
이 그림에는 일반적인 패치 클램프 형광 측정 실험에서 ANAP 태그가 지정된 ATP 민감성 칼륨 채널의 대표 전류 및 스펙트럼이 표시됩니다. 방출 스펙트럼은 지붕이 없는 멤브레인에 대해 입증된 바와 같이 배경 및 표백에 대해 보정됩니다. 형광 신호가 수용체에 특이적인지 확인하기 위해 컨트롤에 주의하십시오.
풍부함이 빠르고 효율적이며 완전한지 확인하고 노출을 가능한 한 짧게 유지하십시오. 이 방법은 수용체 점유 및 기능과 어떤 관련이 있는지에 대한 질문에 답합니다. 유사한 설정으로 사용되는 다른 FRET 기술은 수용체에서 리간드 유도 확인 변화를 조사할 수 있습니다.
