Da ATP ein wichtiger zellulärer Botenstoff ist, haben wir eine Methode entwickelt, mit der wir die Bindung von ATP an seine Rezeptoren mit hoher Präzision messen können. Mit Hilfe von FRET zwischen Nukleotidderivaten und fluoreszenzmarkierten Proteinen können wir die Nukleotidbindung an intakte funktionelle Rezeptoren in Echtzeit und mit ausgezeichneter räumlicher Auflösung verfolgen. Wir verwenden diese Methode, um die Auswirkungen des zellulären Stoffwechsels auf den ATP-sensitiven Kaliumkanal zu verstehen, der an bestimmten Formen von Diabetes beteiligt ist.
Um ein Experiment ohne Dach durchzuführen, verwenden Sie zunächst eine Pinzette, um ein kleines Fragment von einem Deckglas mit transfizierten Zellen zu brechen, und spülen Sie das Fragment mit PBS ab. Wenn das Deckglas mit Polylysin vorbeschichtet ist, legen Sie das Fragment auf den Boden einer 35-Millimeter-Schale mit zwei Millilitern PBS und halten Sie ein Drei-Millimeter-Sonden-Ultraschallgerät drei bis fünf Millimeter über die Probe, das 200 bis 500 Millisekunden lang mit 50 Watt und 20 bis 40 % Amplitude pulsiert, um die Zellen zu öffnen. Wenn die Deckgläser nicht vorbeschichtet sind, tauchen Sie das Fragment nach dem Spülen mit PBS etwa 30 Sekunden lang in ein Röhrchen mit 0,1 % Poly-L-Lysin, bevor Sie die Zellen mit kurzer Beschallung wie gezeigt abdecken.
Übertragen Sie das beschallte Fragment in eine abgedeckte 35-Millimeter-Schale mit Glasboden, die zwei Milliliter Badelösung enthält, und montieren Sie die Schale auf ein inverses Mikroskop, das mit einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur ausgestattet ist. Stellen Sie sicher, dass der Kameraanschluss des Mikroskops mit einem Spektrographen in Reihe mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera verbunden ist, und verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um die Badekammer mit Puffer mit einer Durchflussrate von 0,5 bis einem Milliliter Puffer pro Minute zu perfundieren. Um Membranfragmente ohne Dach zu identifizieren, die den ANAP-markierten Kanal exprimieren, sehen Sie sich die Probe an, um Membranen mit fluoreszierenden Kanälen zu finden.
Greifen Sie die Spektrometermaske teilweise zwischen den Kameraanschluss des Mikroskops und den Spektrographen ein. Der Schatten der Maske erscheint auf dem Kamerabild. Erfassen Sie ein Hellfeld- und Fluoreszenzbild der Membran ohne Dach, um die Auswahl des interessierenden Bereichs für die Analyse zu ermöglichen.
Bringen Sie die Spitze des Mikrovolumen-Perfusionssystems in die Nähe der nicht überdachten Membran. Um ein Bild der ANAP-Fluoreszenz zu erhalten, wird die Membran mit einer 385-Nanometer-LED durch einen 390/18-Nanometer-Bandpass-Anregungsfilter und einen 416-Nanometer-Kantendichroitoidfilter angeregt, wobei das emittierte Licht durch einen 400-Nanometer-Langpass-Emissionsfilter gesammelt wird. Setzen Sie die Spektrometermaske ein und stellen Sie sicher, dass das emittierte Licht durchgelassen wird.
Richten Sie den interessierenden Bereich am Schlitz der Spektrometermaske aus. Setzen Sie die Spektrometergitter ein. Wenn die Gitter angebracht sind, wird das vom Spektrometer gebeugte Licht auf den Chip der CCD-Kamera projiziert, um Spektralbilder zu erzeugen.
Die Bilder behalten räumliche Informationen in der Y-Dimension bei. Die X-Dimension wird durch die Wellenlänge ersetzt. Während Sie mit nukleotidfreier Pufferlösung perfundieren, erhalten Sie eine oder mehrere 0,1- bis zehnsekündige Belichtungen zur nachgeschalteten Korrektur und Normalisierung der Daten, die während des restlichen Experiments gesammelt wurden.
Als Nächstes wenden Sie eine Reihe von TNP-ATP-Konzentrationen in der Badlösung an, um eine Konzentrationsreaktionskurve zu erstellen, und durchbluten Sie jede Lösung mindestens eine Minute lang, um sicherzustellen, dass ein stationärer Zustand erreicht wird, und erhalten Sie eine Exposition für jede Konzentration. Waschen Sie nach jeder Konzentration das TNP-ATP mindestens eine Minute lang mit nukleotidfreier Badlösung aus, bevor Sie ein Belichtungsbild nach der Behandlung aufnehmen. Um ein Patch-Clamp-Fluorometrie-Experiment durchzuführen, ziehen Sie zunächst Patchpipetten aus dickwandigen Borosilikatglaskapillaren auf einen Widerstand von 1,5 bis 2,5 Megaohm, wenn sie mit Pipettenlösung gefüllt sind.
Übertragen Sie anschließend ein Deckglas mit transfizierten Zellen in eine 35-Millimeter-Schale mit Glasboden und zwei Millilitern Badelösung und montieren Sie die Schale auf das inverse Mikroskop. Durchströmen Sie die Badekammer mit Badelösung und identifizieren Sie eine Zelle, die ANAP-markierte Kanäle exprimiert. Üben Sie sanften Überdruck auf eine Patch-Pipette aus und legen Sie die Pipette in eine Badekammer.
Drücken Sie die Pipette gegen die Membran der Zelle und saugen Sie sanft ab, um eine Gigaohm-Abdichtung zu erreichen. Um das Pflaster zu entfernen, bewegen Sie den Pipettenhalter schnell von der gepflasterten Zelle weg. Bringen Sie die Spitze der Patch-Pipette in die Nähe der Spitze des Perfusionssystems und überprüfen Sie, ob sich das Pflaster innerhalb des Schlitzes der Spektrometermaske befindet.
Wenden Sie dann TNP ATP an und sammeln Sie Bildspektren. In diesen Bildern ist ein typisches Membranfragment einer HEK293T Zelle zu sehen, das ATP-sensitive Kaliumkanäle exprimiert, die mit orange fluoreszierendem Protein markiert sind. In diesem Spektralbild von ANAP-markierten ATP-sensitiven Kaliumkanälen in einer unüberdachten Membran einer HEK293T Zelle, die fünf mikromolaren TNP-ATP ausgesetzt war, können zwei Regionen hoher Intensität beobachtet werden, die der Spitzenemission von ANAP und TNP ATP entsprechen.
Ein endgültiges Spektrum kann erhalten werden, indem das gemittelte Hintergrundspektrum vom gemittelten Spektrum des interessierenden Bereichs subtrahiert wird. Hier kann die Abnahme der maximalen ANAP-Fluoreszenz nach Mehrfachbelichtung beobachtet werden. Die maximale Fluoreszenz aus mehreren Belichtungen in Abwesenheit von TNP ATP wurde an einen einzigen exponentiellen Zerfall angepasst.
Diese Daten wurden dann verwendet, um Photobleaching-Artefakte zu korrigieren. In dieser Arbeit werden repräsentative Spektralbilder einer Membran ohne Dach gezeigt, die von einer Zelle erhalten wurde, die ANAP-markierte ATP-sensitive Kaliumkanäle in Abwesenheit und Anwesenheit von TNP-ATP exprimiert. Die Betrachtung der korrigierten Emissionsspektren zeigt eine klare Trennung zwischen Donor- und Akzeptor-Fluoreszenz-Emission.
In dieser Abbildung sind repräsentative Ströme und Spektren von ANAP-markierten ATP-sensitiven Kaliumkanälen aus einem typischen Patch-Clamp-Fluorometrie-Experiment dargestellt. Die Emissionsspektren werden für Hintergrund und Ausbleichen korrigiert, wie dies für unüberdachte Membranen gezeigt wurde. Achten Sie bei den Kontrollen darauf, dass das Fluoreszenzsignal spezifisch für Ihren Rezeptor ist.
Stellen Sie sicher, dass Ihre Fülle schnell, effizient und vollständig ist, und halten Sie Ihre Belichtungen so kurz wie möglich. Diese Methode beantwortet Fragen zur Rezeptorbelegung und wie sie mit der Funktion zusammenhängt. Andere FRET-Techniken, die mit einem ähnlichen Aufbau verwendet werden, können ligandeninduzierte Bestätigungsänderungen im Rezeptor untersuchen.
