Этот метод решает проблемы в наблюдении глубокой флуоресценции в побегах риса, такие как ограниченное проникновение в ткани очищающего раствора и реальное разрешение под конфокальным микроскопом. Основным преимуществом этой методики является наблюдение структуры многих крупных тканей с макроперспективности, даже подсказок с твердыми и толстыми тканями, такими как взрослые эрализованные побеги. Этот метод применяется для глубокой визуализации твердых и толстых тканей у широких видов растений.
Это может помочь ускорить открытие новых явлений в биологических исследованиях растений. Для начала аккуратно обрежьте корни, не повредив растения, и промойте их водой, чтобы удалить грязь. Теперь используйте пинцет, чтобы очистить старые внешние листья.
Чтобы избежать дробления клеток, используйте однолезвийную бритву со скользящим движением, чтобы срезать ткань от побега, апикальной меристемы или молодой метелки до основания. Если положение побега апикальной меристемы или молодой метелки не видно, обрежьте ее дольше. Побег риса имеет овальное поперечное сечение.
Используйте обоюдоострую бритву, чтобы тонко сбрить одну сторону овала, в направлении его длинной оси. Подтверждают положение побега апикальной меристемы или молодой метелки появлением в образце беловатого цвета и обрезают лишнюю ткань. Поместите образец в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую один миллилитр фиксаторного раствора.
Вырежьте кусок парафиновой пленки площадью 2,5 квадратных сантиметра и придайте ему форму шара. Теперь поместите эти шарики поверх образцов, чтобы они не выплывали из фиксирующего раствора. Поместите пробирку, содержащую образец, в осушитель.
Закройте крышку осушителя и запустите вакуумный насос, чтобы медленно разгерметизировать внутреннюю часть осушителя до тех пор, пока не будет достигнуто давление минус 0,095 мегапаскаля. После закрытия осушителя при минус 0,095 мегапаскаля выключите вакуумный насос и дайте ему постоять 30 минут при комнатной температуре. Слегка откройте осушитель и медленно верните его к атмосферному давлению.
Если образец правильно зафиксирован, он погружается в фиксирующий раствор. И если он не тонет, снова уменьшите давление. Снимите парафиновую пленку.
Закройте крышку и держите трубки на ночь при четырех градусах Цельсия. С помощью безворсовых салфеток удалите из образец лишний фиксирующий раствор и зафиксируйте образец на вибрирующем лотке микролайсера с помощью мгновенного клея. Поместите образец на лоток плоской стороной вниз, который был сбрит во время отбора проб, и установите условия обрезки в соответствии с фиксированным образцом.
Отрегулируйте положение образца с помощью кнопки «Назад» или «Вперед» и кнопки «Вверх» или «Вниз» и заполните лоток деионизированной водой до тех пор, пока все образцы не будут погружены. После заполнения лотка нажмите кнопку запуска и поместите обрезанные образцы на стеклянный слайд с каплей PBS. Проверьте образец, содержащий целевой участок, под стереомикроскопом и перенесите обрезанный образец на многолуночную пластину с одним миллилитром PBS.
Снимите PBS с многоскважинной пластины. Добавьте свежий PBS и дайте ему постоять в течение одной минуты. Удалите PBS и добавьте CS. Поместите многолуночную пластину, содержащую образец, в осушитель и закройте крышку.
Затем запустите вакуумный насос, чтобы разгерметизировать внутреннюю часть осушителя до минус 0,09 мегапаскаля, медленно. После закрытия осушителя при минус 0,09 мегапаскаля выключите вакуумный насос и дайте ему постоять в течение одного часа при комнатной температуре. Слегка откройте осушитель и медленно верните его к атмосферному давлению.
Налейте деионизированную воду в зазор между скважинами, чтобы предотвратить испарение CS и храните многоскважинные плиты при комнатной температуре в темноте для очистки. Когда CS станет зеленым, замените его свежим раствором. Необрезанные образцы оставались зелеными и не становились прозрачными после трех месяцев обработки CS.In образцы, которые были очищены от всех листьев, межузлы стали белыми через одну неделю, хотя узлы остались зелеными.
Проба не стала прозрачной через четыре недели. Обрезанные вручную образцы стали белыми после одной недели лечения CS, но не стали прозрачными через четыре недели. Образцы, обрезанные до толщины 130 микрометров, стали полупрозрачными после одной недели обработки CS.
Образец был почти прозрачным через две недели. В узле наблюдаемая глубина после одной недели лечения КС составляла минус 60 микрометров и минус 90 микрометров через две недели. Флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине минус 80 микрометров через три недели и на глубине минус 100 микрометров через четыре недели.
В междоузливом состоянии флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине минус 60 микрометров без обработки КС. Наблюдаемая глубина составляла минус 90 микрометров после одной недели до трех недель лечения CS и минус 100 микрометров через четыре недели. В листьях флуоресцентные сигналы наблюдались на глубине минус 90 микрометров без обработки КС, но яркость была слабее, чем у других тканей.
Через неделю сигналы стали ярче и наблюдались на глубине минус 120 микрометров. Экспрессия транскрипционного фактора OS MASU 15 mOrange наблюдалась у молодой метелки, листа, узла, междоузлия и флеретта. Ключ заключается в том, чтобы найти наилучшие условия для растений или тканей, например, период и вакуумное давление, или положение, а также обработку CS, время, толщину, скорость и соответствующий раствор для окрашивания.
Сочетание технологии синхронизации и отверждения позволяет пространственно-временно наблюдать паттерн экспрессии генов и межклеточную связь в нескольких тканях одного участка.
