Молодые соцветия, как explant для производства каллуса имеют важное значение для создания быстрой и эффективной трансформации генов и метод регенерации для выявления функции гена, а также для улучшения урожая. Молодые соцветия как эксплант для производства каллуса имеют важное значение для создания быстрой и эффективной трансформации генов и метода регенерации для выявления функции генов. Видео демонстрация этой техники поможет зрителю понять процесс поддержания материалов для производства желаемого трансгенного выравнивания, не теряя времени и усилий.
Начните с сбора молодых соцветий риса из рисового поля или теплицы на стадии мейоза, убедившись, что они покрыты листом оболочки. Протрите каждую соцветие с 70% спиртового тампона и дайте ему высохнуть перед резки. Принесите соцветие на стерильную скамейку лаборатории и разрежьте его на мелкие кусочки с стерилизованными ножницами, а затем перенесите черено на пластину Петри, содержащую NBD2 среды.
Инкубировать пластину в темноте при 26 градусах по Цельсию в течение 10 до 14 дней, чтобы вызвать каллуса. Для выполнения трансформации перенесите одну колонию из белой пластины EB с селективными антибиотиками в пять миллилитров жидкой среды YEB, содержащей те же антибиотики в 50 миллилитровой конической стерильной пробирке. Встряхните трубку на орбитальном шейкере в 250 раз г и от 25 до 28 градусов по Цельсию, пока бактерии не вырастут до OD 600 из 0,5.
Добавьте один миллилитр бактериальной суспензии в 100 миллилитров среды YEB с теми же селективными антибиотиками в конической колбе 250 миллилитров и встряхните колбу на орбитальном шейкере при 250 раз g и 28 градусах Цельсия в течение четырех часов. Центрифуга культуры на 4000 г в течение 10 минут при комнатной температуре для сбора бактерий. Отбросьте супернатант и повторно посовепайте гранулы со средой AAM AS, затем разбавьте подвеску до OD 600 из 0.4.
После инкубации соберите около 150 здоровых светло-желтых эмбриональных калли в стерильную колбу на 150 миллилитров. Добавить от 50 до 75 миллилитров бактериальной клеточной суспензии в колбу, а затем добавить от 10 до 25 миллилитров свежих AAM AS среды, чтобы погрузить калли в течение 10 до 20 минут, встряхивая время от времени. Налейте бактериальную суспензию из колбы тщательно и высушите калли стерильной фильтровальной бумагой, затем поместите их на чашку Петри со средой NBD AS и накройте их фильтровальной бумагой.
Инкубировать калли при 25 до 28 градусов по Цельсию в темноте в течение трех дней, проверяя их на бактериальный разрастание. После трех дней совместного выращивания, перенесите калли в стерильную чашку Петри с помощью фильтровальной бумаги, затем высушите их в течение двух часов на чистой скамейке. Убедитесь, что калли не привязаны к фильтровальной бумаге и перенесите их в среду первичного отбора NBD2.
Через две недели, передача калли равномерно на новую тарелку, содержащую свежие среды отбора, а затем переместить калли на свежие MS среды для дифференциации и стрелять почки MS среды с 10 миллиграммов на литр Hygromycin размножаться больше побегов. Передача новых побегов в половину MS среды для корневой индукции и культуры их под светом при 25 до 28 градусов по Цельсию. Преобразованные растения должны производить корни в течение двух недель.
Для выполнения наблюдения репродуктивного фенотипа удалите палею и лемму из витиеватого и изображения целых пыльей под стерео микроскопом. Чтобы наблюдать за жизнеспособностью пыльцы, выберите зрелые рисовые шипы перед цветочным антезом и удалите палею и лемму, чтобы освободить пыльники. Возьмите шесть пыль в пыль и поместите их на стеклянную горку.
Добавить одну каплю дистиллированной воды, раздавить пыль с пинцетом, чтобы освободить пыльцы зерна, а затем добавить две-три капли йодного раствора и накрыть крышкой. Наблюдайте за слайдом под микроскопом с низким увеличением. Пыльца зерна окрашены черный показать более энергичную жизнеспособность в то время как зерна без цвета или те окрашенные желто-коричневый отстают или вырождаются.
Для выполнения поперечной секционой микроскопии используйте 0,5%толуидин синий раствор, чтобы испачкать горки в течение 30 минут, затем промыть их водой и высушить их в дымовой капот. После высыхания, печать слайды с нейтральным клеем дерева, осторожно поместите крышку на слайде и высушить их в дым капот, а затем изображение образца под микроскопом. Этот протокол был использован для создания мужской стерильной линии Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации риса.
Эмбриональные калли были непосредственно использованы для преобразования или субкультуры для распространения, чтобы получить больше калли для дальнейшей инфекции. После совместного культивирования в течение 48 часов, калли были перенесены на второй раунд отбора среды. Через 10-14 дней трансформированные калли показали недавно сформированные микрокалли, в то время как непереведенный калли посихонькался и умер.
Позже, здоровые и сливочные цветные калли были переведены в регенерации среды. Преобразованный калли постепенно показал зеленые пятна. Эти зеленые пятна были выуцированы в среде регенерации для того чтобы позволить для роста съемки и после этого перенесены в половину средства MS для того чтобы навести корни.
Позже были собраны здоровые и энергичные растущие побеги с хорошо развитыми корнями. Всего было получено 21 регенерированная рассада. Усиление ПЦР в регионе Гигромицин показало, что частота трансформации составила примерно 85,71%Трансформанты были генотипированными для выявления мутаций на целевых участках sgRNA.
Среди 18 трансгенных растений восемь гетерозиготных линий и три гомозиготные линии были положительными CRISPR CAS9. Гомозиготные нокаут-мутанты были подтверждены основным наблюдением мужских репродуктивных органов. Пыль osabcg15 были меньше и бледнее, чем у дикого типа и не хватало зрелых зерен пыльцы.
Поперечная секционая микроскопия была проведена для исследования антер морфологических дефектов в osabcg15. На стадии 10 микроспоры дикого типа стали круглой формой и вакузолировали темно-синими окрашенными экзинами. В отличие от этого, osabcg15 микроспоры рухнули и деградировали.
При попытке этого протокола, важно, чтобы собранный материал находится в стадии мейоза и контролировать сухое время воздуха калли.
