0. Наш протокол описывает оптимизированный и воспроизводимый метод получения остеокластов in vitro, который может быть использован для исследования механизмов, лежащих в основе процесса их дифференцировки и функциональности. Основным преимуществом этого метода является способность генерировать большое количество функционально активных остеокластов всего за неделю. Высокий выход дифференцировки достигается за счет использования очищенных моноцитов и своевременного добавления цитокинов.
Остеокласты ответственны за разрушение костей при всех формах артрита, и этот метод предоставляет инструменты для скрининга новых терапевтических соединений, которые могут модулировать их дифференцировку и / или функции. Продемонстрирует процедуру Патрисия Ридлова, аспирант нашей лаборатории. Для начала изолируйте PBMC, перелив кровь в новую 50-миллилитровую пробирку.
Разбавьте его стерильным PBS в равном объеме для свежей крови или в соотношении 1:3 для лейкоцитарных шишек и охристой шерсти. Аккуратно перемешайте кровь путем инверсии. Подготовьте 15-миллилитровые пробирки, содержащие три миллилитра среды градиента плотности, и медленно нанесите от восьми до 10 миллилитров разбавленной крови поверх среды градиента плотности, избегая смешивания.
Центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 30 минут при комнатной температуре без тормозов. Затем аккуратно сбросьте верхний слой с помощью пастеровской пипетки. Соберите нижний межфазный слой, содержащий PBMC, и перенесите этот слой в новую 50-миллилитровую пробирку.
Суспендировать клетки до 50 миллилитров стерильным PBS и смыть остаточную среду градиента плотности центрифугированием при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре с полным тормозом. Чтобы удалить остаточные тромбоциты, повторите процесс центрифугирования, как описано в рукописи, ресуспендируйте выделенные и очищенные PBMC в 20 миллилитрах PBS и подсчитайте их с помощью гемацитометра в соответствии со стандартным методом. Чтобы обогатить CD14 + моноциты, перенесите 1 x 10 в седьмой PBMC в подходящую полистирольную пробирку с круглым дном и гранулируйте клетки в 300 x g в течение пяти минут.
После удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования клеточной гранулы в буфере для разделения клеток инкубируйте клетки с 10 микролитрами коктейля антител на 100 микролитров с закрытой крышкой в течение 10 минут. В конце инкубации добавьте 10 микролитров шариков магнитных наночастиц на 100 микролитров и выдерживайте в течение трех минут под крышкой. Дополните объем до 2,5 миллилитров буфером для разделения ячеек.
Поместите трубку в магнит и выдерживайте в течение трех минут со снятой крышкой. Теперь отбросьте популяцию отрицательных клеток одним непрерывным движением путем инверсии, пока трубка все еще находится в магните. Снимите трубку с магнита, промойте обогащенные CD14 + моноциты, прикрепленные к магнитным шарикам, ресуспендировав их в 2,5 миллилитрах буфера клеточной суспензии, и поместите трубку обратно в магнит.
Подсчитайте изолированные клетки, как показано ранее. Центрифугируйте собранные клетки при 300 х г в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клетки в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр в полной альфа-минимальной незаменимой среде с 10% FBS.
Чтобы дифференцировать остеокласт, добавьте M-CSF в конечной концентрации 25 нанограммов на миллилитр в клеточную суспензию и тщательно перемешайте путем пипетки для гомогенизации клеточной суспензии. Пластина 100 микролитров суспензии на лунку в плоскодонной 96-луночной пластине. Затем добавьте 200 микролитров стерильной дистиллированной воды в каждую лунку вокруг покрытых клетками, чтобы предотвратить испарение среды и краевые эффекты в системе культивирования.
Инкубируйте клетки в течение ночи примерно от 18 до 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Приготовьте свежий носитель с добавлением M-CSF и лиганда RANK. После инкубации осторожно удалите половину среды путем аспирации с помощью пипетки P200 и замените ее свежей теплой полной средой с добавлением лиганда M-CSF и RANK в конечной концентрации 25 нанограмм на миллилитр.
Дифференцируют клетки в остеокласты в течение семи-14 дней с полной заменой среды каждые три дня. После удаления среды зафиксируйте дифференцированные прилипшие остеокласты 100 микролитрами на лунку приготовленного фиксирующего раствора и выдержите в течение одной минуты. Не прикасайтесь ко дну лунок, чтобы не поцарапать прилипшие ячейки.
После того, как лунки будут промыты три раза 300 микролитрами стерильной дистиллированной воды, высушите пластины и добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежеприготовленного окрашивающего раствора. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 20 минут. После инкубации удалите окрашивающий раствор путем инверсии и трижды промойте тарелку дистиллированной водой в количестве 300 микролитров на лунку.
Удалите лишнюю воду, постукивая тарелками по бумажным полотенцам, и оставьте тарелки открытыми и защищенными от света, чтобы они высохли на воздухе на ночь. Используя светлопольный микроскоп с опцией плитки, сделайте снимки с 10-кратным или 20-кратным увеличением, чтобы захватить всю поверхность лунки. Вручную подсчитайте остеокласты, идентифицированные как окрашенные в TRAP + фиолетовый цвет клетки с более чем тремя ядрами, с помощью программного обеспечения для анализа изображений с плагином счетчика клеток.
Планшет 100 микролитров изолированных CD14 + моноцитов на лунку в 18-луночной камере с плотностью клеток 1 x 10 до пятой клетки на лунку. Дифференцируйте остеокласты в присутствии лиганда M-CSF и RANK, как было показано ранее, с полной сменой среды каждые три дня. В конце времени аккуратно удалите среду и дважды промойте каждую скважину 200 микролитрами предварительно подогретого PBS при pH 7,4.
Не допускайте высыхания лунок между ступенями. Зафиксируйте образец 100 микролитрами на лунку 4%-ного раствора формальдегида в PBS и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере с легким встряхиванием. После инкубации дважды промойте клетки 200 микролитрами PBS на лунку.
Пермеабилизируют клетки 100 микролитрами на лунку 0,1% раствора Triton x-100, разбавленного в PBS, и инкубируют в течение 10 минут, как показано ранее. Дважды промойте PBS по 200 микролитров на лунку. Чтобы блокировать неспецифическое связывание и увеличить сигнал, добавьте 100 микролитров блокирующего раствора, приготовленного из 2% бычьего сывороточного альбумина и раствора PBS.
Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере с легким встряхиванием. После удаления блокирующего раствора добавьте в каждую лунку 100 микролитров флуоресцентно конъюгированного раствора фаллоидина, разведенного в 2%-ном растворе BSA/PBS. Дважды промойте PBS по 200 микролитров на лунку.
Окрашивают ядра раствором PBS, содержащим 300 наномолярных DAPI, по 100 микролитров на лунку. Через 10–15 минут удалите раствор DAPI и замените его PBS со скоростью 100 микролитров на лунку. Визуализируйте окрашивание с помощью соответствующих иммунофлуоресцентных или конфокальных микроскопов в диапазоне от четырех до 40 раз.
Зрелые остеокласты определяются как TRAP + множественные ядерные клетки. Добавление лиганда RANK приводило к увеличению количества больших многоядерных остеокластов TRAP + дозозависимым образом. Кинетику дифференцировки остеокластов из моноцитов исследовали в течение периода культивирования от двух до 14 дней.
Многоядерные остеокласты были видны с пятого дня, а оптимальная дифференцировка была достигнута на седьмой день. Дифференциация остеокластов на минерализованные поверхности позволяет оценить их резорбционную активность путем анализа образования круглых отверстий, или резорбционных ям. Процент резорбции значительно увеличивается в присутствии М-КСФ и лиганда RANK по сравнению с одним М-КСФ.
Кроме того, обработка ротеноном дозозависимо ингибировала резорбцию минерализованной поверхности по сравнению с необработанной контрольной скважиной. Ротенон-зависимое ингибирование резорбции остеокластов ассоциировалось с ингибированием продукции АТФ. Фрагментация актинового кольца, полученного из лиганда RANK, зрелого OCS наблюдалась в присутствии ротенона.
Важно убедиться, что обогащенные моноциты не содержат тромбоцитов, что клетки покрыты с нужной плотностью, а окружающие лунки заполнены водой, чтобы избежать краевого эффекта. Этот протокол особенно полезен для механистического исследования того, как образуются остеокласты и что влияет на их функциональность как в фундаментальной, так и в трансляционной науке. Например, с помощью соединений или белков, которые могут модулировать эти процессы.
